固相萃取/气相色谱法测定禽蛋中19种农药残留

李敏青，安文佳*，李 菊，王 岚，庄 嘉，何曼莉

(1.广州海关技术中心，广东 广州 510623；2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623)

2017年8月初，荷兰爆出鸡蛋受杀虫剂大范围污染的“毒鸡蛋”事件，随后几乎蔓延至全世界，成为影响极大的食品卫生丑闻，一时间使禽蛋的食品安全问题受到广泛关注。蛋类和肉类、奶类一样在中国的居民饮食结构中占有非常重要的地位，但其检测方法标准远不及肉类和奶类全面。我国禽蛋产量自1985年跃居世界第一位以来，已连续30多年保持世界首位，鲜蛋主要出口香港、澳门和日本[1-2]。目前，我国标准《GB2763-2016食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》仅对蛋类中9种有机氯类农药作最大残留限量(MRLs)要求[3]，中国香港特别行政区《食物内残余除害剂规例》规定禽蛋中MRLs的农药有109种[4]，国际食品法典委员会(CAC)、欧盟、美国和日本等国家组织和地区亦均对蛋类中上百种农药作最大残留限量规定，包括有机磷类农药与拟除虫菊酯类农药，且最低限量要求为0.01 mg/kg[5-8]。这两类杀虫剂是我国广泛使用的农药品种,主要用于蔬果和粮食作物的虫害防治,但因其环境安全性问题,被列为重点检测对象。

禽蛋这类动物源食品的基质及其特有的乳化性，使得前处理中提取净化过程复杂，难度大，目前为止，我国尚未有关于禽蛋的多种农药残留检测方法的标准，且对蛋类中非有机氯杀虫剂残留检测的报道较少。调研现有文献发现，禽蛋中农药残留的检测主要采用气相色谱法[9-10]、气相色谱-质谱法[11]、气相色谱-串联质谱法[12-14]或液相色谱-串联质谱法[15-17]，但其所用质谱仪器较昂贵,检测成本高。基于火焰光度检测器(FPD)和电子捕获检测器(ECD)分别对有机磷类农药和拟除虫菊酯类农药的检测灵敏度很高，同时气相色谱仪在基层实验室较为普及，为填补相应空白，满足中国香港《食物内残余除害剂规例》，保证供港禽蛋品质，本文建立了一种更为方便高效并能广泛应用于不同鲜禽蛋中的多种有机磷类、拟除虫菊酯类农药同时测定的前处理方法,为保证禽蛋安全提供技术支撑,适用于大多数没有色谱-质谱联用仪的实验室。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B型气相色谱仪(配FPD)和7890A型气相色谱仪(配ECD)均购于美国Agilent公司；XP205分析天平(感量0.01 g和0.000 1 g，瑞士Mettler公司)；Sigma-3-18K高速低温离心机(德国Sigma公司)；Turbo Vap LV氮吹仪(瑞典Biotage公司)；Heidolphpromax 2020水平往复振荡仪(德国Heidolph公司)；IKA Ms 3 Basic涡旋振荡器(德国IKA公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

乙腈、乙酸乙酯(色谱纯，美国Tedia公司)；QuEChERS提取盐包(CEN EN-15662，内含0.5 g倍半水合柠檬酸二钠，1 g柠檬酸钠，1 g氯化钠，4 g无水硫酸镁，美国Shimadzu-GL公司)；氟甲腈(Fipronil-desulfinyl)、氟虫腈硫醚(Fipronil sulfide)、氟虫腈(Fipronil)、氟虫腈砜(Fipronil sulfone)、联苯菊酯(Bifenthrin)、甲氰菊酯(Fenpropathrin)、氯菊酯(Permethrin)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、氰戊菊酯(Fenvalerate)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、敌敌畏(Dichlorvos)、甲胺磷(Methamidophos)、乙酰甲胺磷(Acephate)、二嗪磷(Diazinon)、乐果(Dimethoate)、甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、杀螟硫磷(Fenitrothion)、丙溴磷(Profenofos)19种农药标准物质纯度不低于98.5%，购自德国DR.E公司；石墨化炭黑(GCB)吸附剂(500 mg，3 mL，上海安谱公司)；C18固相萃取柱(500 mg，3 mL，Waters公司)；0.22 μm有机微孔滤膜(津腾公司)；实验用水为经Milli-Q纯水系统制备的超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

1.2 溶液配制

标准储备液：分别准确称取适量19种农药标准品，用乙酸乙酯分别配成质量浓度为100 mg/L的单标储备液，于0～4 ℃避光保存。混合农药标准储备液：取适量19种农药的单标储备液，以乙酸乙酯为溶剂，分别将有机磷类农药、拟除虫菊酯类农药和氟虫腈及其代谢物标准储备液配成质量浓度均为10 mg/L的混合标准储备液，避光冷藏保存。实验时根据需要，再用乙酸乙酯逐级稀释成不同质量浓度的系列混合标准工作溶液，现用现配。

1.3 样品前处理

1.3.1 加水处理将蛋品去壳，用搅拌机混合蛋液制成匀浆，称取约10.0 g蛋液样品(精确至0.01 g)于50 mL具塞塑料离心管中，加入6 mL超纯水，涡旋混匀30 s。

1.3.2 提 取向经过加水处理的蛋液样品中加入10 mL乙腈，水平振荡提取10 min，再向提取液中加入QuEChERS提取盐包，迅速摇匀且水平振荡5 min，将离心管置于4 ℃冷冻离心机中以9 000 r/min离心5 min，准确吸取2.5 mL提取液于试管中，于40 ℃下氮吹至干后，用乙酸乙酯复溶至1 mL，待净化。

1.3.3 净 化称取100 mg石墨化炭黑(GCB)吸附剂于C18固相萃取柱中，用4 mL乙酸乙酯(分2次，每次2 mL)活化SPE柱，弃去流出液。吸取上述待净化提取液至SPE柱中，使样液以1 mL/min的流速通过，用3 mL乙酸乙酯(分3次，各1 mL)洗脱并收集洗脱液，将洗脱液于40 ℃氮吹浓缩至小于1 mL，再用乙酸乙酯定容至1.0 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 仪器条件

1.4.1 ECD检测器气相色谱条件Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm，0.25 μm)色谱柱；载气：高纯氮气，3 mL/min；进样体积：1 μL；不分流进样；进样口温度：260 ℃；检测器温度：320 ℃；尾吹气：高纯氮气，60 mL/min；柱温箱升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至240 ℃后，以10 ℃/min升至260 ℃，保留30 min，总运行时间38 min。外标法定量。

1.4.2 FPD检测器气相色谱条件Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm，0.25 μm)色谱柱；载气：高氮气，3 mL/min，进样体积：1 μL，不分流进样，进样口温度：270 ℃，检测器温度：245 ℃，氢气：75 mL/min，空气：100 mL/min，尾吹气：高纯氮气，60 mL/min，柱温箱升温程序：初始温度110 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至160 ℃后，保留2 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，保留7 min，最后以25 ℃/min升至270 ℃，保留8 min，总运行时间35 min。外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

由于鲜蛋中富含蛋白质、脂肪以及维生素等营养成分，对农药测定干扰较大，鉴于各种分析物在不同溶剂中的溶解性，实验考察了乙腈、乙酸乙酯、正己烷-丙酮(体积比1∶1)3种溶剂对鲜蛋中19种农药的提取效果。结果显示，3种溶剂对目标化合物的提取效率均达到70%以上，且以乙腈的提取效率普遍最高，正己烷-丙酮次之，乙酸乙酯最低。再比较经3种溶剂提取浓缩后无法蒸干的油脂与杂质发现，乙腈提取液中的共提取物较乙酸乙酯和正己烷-丙酮少。因此，实验选择乙腈为提取溶剂。另外，由于蛋液样品具有一定黏性，单纯使用乙腈提取可能存在分散不完全的现象，向其中加入少量水，可显著提高乙腈对样品的渗透性，将基体分散的更均匀，既可提高乙腈对目标物的提取效率，又减少了蛋液中主要干扰杂质的溶入量，利于后续净化。

2.2 除水剂的选择

向经加水处理后的蛋液样品中加入10 mL乙腈，水平振荡提取10 min后，分别考察加入2 g氯化钠、3 g氯化钠、1 g氯化钠+4 g无水硫酸镁或QuEChERS提取盐包(1 g氯化钠、4 g无水硫酸镁、1 g柠檬酸钠、0.5 g倍半水合柠檬酸二钠)4种不同除水剂对提取效率的影响。结果显示，单独加入NaCl的量多于2 g时，蛋液粘稠度增大，出现乳化现象，而加入NaCl用量少于2 g时，水分不能完全去除。1 g氯化钠+4 g无水硫酸镁或QuEChERS提取盐包的除水效果均较佳，但对于一些pH值较敏感的农药(如敌敌畏、甲胺磷、乐果和拟除虫菊酯类农药)，采用QuEChERS提取盐包的回收率明显较高，这是由于加入柠檬酸钠和倍半水合柠檬酸二钠形成一个稳定的弱酸性缓冲体系，可使这类农药保持稳定，从而提高了提取效率[18]。因此，本实验选择QuEChERS提取盐包(1 g氯化钠、4 g无水硫酸镁、1 g柠檬酸钠、0.5 g倍半水合柠檬酸二钠)进行除水。

2.3 离心方式的选择

无水硫酸镁除水时会放热，使萃取液温度升高更利于农药萃取，但同时可能增加了禽蛋中脂溶性杂质在乙腈提取液中的溶入量。因此，实验对比了禽蛋中经乙腈及QuEChERS提取盐包振荡提取后，冷冻离心与常温离心的提取液分层状态。结果发现，经冷冻离心后的乙腈层表面呈现一层薄薄的白色片状脂肪层，而常温离心后的乙腈层则完全溶解且均匀。因此，本实验采用冷冻离心以便后续净化操作。

2.4 净化小柱的选择

为更好地去除提取液中溶入的蛋液脂肪、色素、蛋白质等杂质，实验考察了以下4种不同SPE柱或混合柱方案的回收率：①100 mg GCB吸附剂+C18SPE柱(500 mg，3 mL)；②GCB/PSA混合柱(200 mg/200 mg，3 mL)；③500 mg Florisil吸附剂+GCB SPE柱(250 mg，3 mL)；④EMR-LipidSPE柱(300 mg，3 mL)。结果显示，净化方案①和④对19种化合物的回收率较好，分别为59.2%～113%和51.2%～130%，且两者对样品基质的除杂净化效果相当。但由于EMR-Lipid固相萃取柱的操作中要求待净化液和洗脱液中含有20%水[19]，其后又须脱水处理，操作繁琐费时。因此，在满足检测要求的前提下，综合考虑检测成本及提取效率，选取100 mg GCB吸附剂+C18SPE柱(500 mg，3 mL)净化。

2.5 洗脱溶剂的选择

以GCB吸附剂+C18SPE柱作为净化柱，考察了乙腈、乙酸乙酯和正己烷-丙酮(体积比1∶2) 3种洗脱溶剂的洗脱效果。结果显示，乙酸乙酯对拟除虫菊酯类农药和个别有机磷农药的洗脱效果优于乙腈，而采用正己烷-丙酮(体积比1∶2)溶剂洗脱时，引入了较明显的杂质峰，且杂质与待测物不能完全分离，导致大多数农药回收不稳定。因此，实验选用乙酸乙酯进行洗脱。

2.6 仪器参数的优化

拟除虫菊酯类和有机磷类农药的常用测定方法有气相色谱-电子捕获检测法/火焰光度检测法、气相色谱-质谱法、超高效液相色谱-串联质谱法等。其中电子捕获检测器(ECD)和火焰光度检测器(FPD)分别对拟除虫菊酯类农药、氟虫腈及其代谢物和有机磷类农药具有高选择性和高灵敏度，与质谱相比，成本低廉且操作简便，因此本方法选择GC/ECD和GC/FPD分别对拟除虫菊酯类农药、氟虫腈及其代谢物和有机磷类农药进行检测。

另外，影响农药分离的主要因素包括色谱柱、载气流速和程序升温过程等，由于本研究所涉及目标化合物的极性范围较广，因而选择中等极性色谱柱Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm,0.25 μm)进行分离富集。载气流速和程序升温条件参考文献[20]优化而得，详见“1.4”，使沸点低、极性较小的成分先流出，同时可将色谱柱中残留的组分完全挥发，避免样品间残留杂质的干扰。在各自最优气相色谱条件下对6种拟除虫菊酯类农药、氟虫腈及其代谢物和9种有机磷类农药进行分离检测，22 min内即可实现全部分析物出峰，通过气相色谱保留时间定性,19种农药在鸡蛋中的加标色谱图见图1。

图1 空白鸡蛋样品中添加6种拟除虫菊酯农药(添加水平5 μg/kg)和氟虫腈及其代谢物(添加水平2 μg/kg)的色谱图(A)及添加9种有机磷农药的色谱图(B)Fig.1 Gas chromatogram of 6 kinds of pyrethroid pesticides(5 μg/kg) and fipronil and its metabolites (2 μg/kg)(A) and 9 kinds of organophosphorus pesticides(10 μg/kg)(B) in egg 1.fipronil-desulfinyl,2.fipronil sulfide,3.fipronil,4.bifenthri,5.fenpropathrin,6.fipronilsulfone,7.permethrin, 8.cypermethrin,9.fenvalerate,10.deltamethrin,11.dichlorvos,12.methamidophos,13.acephate,14.diazinon, 15.dimethoate,16.pirimiphos-methyl,17.chlorpyrifos,18.fenitrothion,19.profenofos

2.7 方法学验证

2.7.1 线性范围、检出限与定量下限取氟虫腈及其代谢物质量浓度为4、8、16、24、32 μg/L，拟除虫菊酯类农药为10、20、40、60、80 μg/L，有机磷农药为20、50、80、100、200 μg/L的混合标准工作液，在优化条件下测定，以各待测物的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线，并分别以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10计算方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。结果显示，19种农药在一定质量浓度范围内线性良好，相关系数(r2)均不低于0.999 3，LOD为0.138～8.33 μg/kg,LOQ为0.461～27.8 μg/kg，结果见表1。实验采用基质匹配标准溶液考察了基质效应的影响，发现拟除虫菊酯类农药和氟虫腈及其代谢物在使用电子捕获检测器分离检测时，以及有机磷类农药在添加水平为40 μg/kg时，采用基质匹配标准溶液定量结果与采用标准溶液定量结果差别不大；有机磷添加水平在10～20 μg/kg时，少数化合物(敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、乐果)略有增强基质效应，但处在可接受范围内，因此实验直接使用标准溶液定量，可满足快速高通量的检测需求。

2.7.2 回收率与相对标准偏差向空白鸡蛋样品中分别添加低、中、高3个浓度的19种农药混合标准液，每个浓度平行实验6次，在优化条件下测定，计算各化合物的回收率及相对标准偏差(RSD)。结果显示，氟虫腈及其代谢物(氟甲腈、氟虫腈硫醚及氟虫腈砜)的平均回收率为78.6%～103%，拟除虫菊酯类(联苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯及溴氰菊酯)农药的平均回收率为82.9%～103%，RSD为1.7%～7.9%，有机磷类(敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、二嗪磷、乐果、甲基嘧啶磷、毒死蜱、杀螟硫磷及丙溴磷)农药的平均回收率为85.3%～105%，RSD为1.6%～5.5%(表1)，回收率和精密度均能满足有机磷类和拟除虫菊酯类农药同时分析的要求,所建方法重复性良好，符合《GB/T 27404-2008实验室质量控制规范要求》[21]。

表1 19种化合物的线性范围、线性方程、相关系数、平均回收率、相对标准偏差(RSD)、检出限及定量下限Table 1 Linear ranges,calibration curves,linear correlations coefficients(r2),average recoveries,relative standard deviations(RSDs,n=6),limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 19 kinds of compounds

图2 鸭蛋样品中检出氟虫腈及其代谢物阳性色谱图Fig.2 Gas chromatogram of fipronil and its metabolites in duck’s egg1.fipronil desulfiny,2.fipronil sulfide,3.fipronil,4.fipronil sulfone

2.8 实际样品检测

采用本方法对市售40个鲜蛋样品(鸡蛋、鸭蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋各10个)进行检测。结果显示，1批次鸡蛋、2批次鸭蛋、1批次鹌鹑蛋中检出氟虫腈及其代谢物，检出结果为氟虫腈及其代谢物之和，以氟虫腈表示，含量为12.5～24.7 μg/kg，其余鲜蛋均未检出。其中一个鸭蛋阳性样品的色谱图见图2。

3 结 论

本研究建立了QuEChERS提取盐包和固相萃取柱净化技术结合气相色谱对鲜蛋中的9种有机磷、6种拟除虫菊酯类农药和氟虫腈及其代谢物同时分析的方法，方法操作简单高效、可靠稳定，能够及时应对大批量鲜蛋样品中农药多残留同时检测的任务。