虎杖提取物对肺炎支原体感染后小鼠心肌损伤的干预作用

吕佳佳， 姜永红

作者单位：200032上海，上海中医药大学附属龙华医院儿科

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)已成为引起儿童肺炎的常见病原体，其主要通过呼吸道飞沫传播。近年来肺炎支原体肺炎病例有逐渐上升的趋势，国内有地区报道，MP居各种病原体感染的首位[1]。MP易引起重症和多系统损伤，肺炎支原体肺炎的肺外表现主要以心血管系统受累最为常见，罗献民[2]研究显示感染MP的患儿均有不同程度的心肌酶谱升高。除外，还表现为心率增快、心音低钝等，心肌炎和心律失常，严重者可导致心力衰竭，甚至心源性休克。

MP感染并发心肌损伤国内研究较少，年幼时心肌损伤可能和成年后心肌病有一定的关联，因此早期关注和发现患儿的心肌损伤，并积极加以治疗干预，对儿童的健康成长有一定的帮助。本研究旨在应用虎杖提取物干预MP感染后小鼠的心肌损伤，保护受损的心脏功能，对改善感染MP合并心肌损伤患儿的预后有积极的临床意义。

1 材料与方法

1.1 中药提取及制备 虎杖购置于上海康桥中药饮片有限公司(批号：160721)。取虎杖200 g，置于3 L圆底烧瓶中，加6倍95%乙醇回流提取两次，第一次4 h，纱布过滤；第二次2 h，纱布过滤，合并两次的过滤液，将滤液置于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪调节温度至60 ℃，回收乙醇。将药液倒入蒸发皿中于70 ℃烘箱中烘干，制成粉末。小鼠用药剂量换算采用Bios氏公式，体质量按20 kg儿童计算，虎杖根据儿童临床用量为9 g，Da=9 g/20(kg·d)，Db=Da×12.33=110.97 g/20(kg·d)。将虎杖提取物溶于双蒸水中，小鼠用量为0.25 mL/20 g，虎杖提取物浓度为443.88 g/L。

1.2 支原体菌株及培养基 MP国际标准株MPFH(美国ATCC，货号：15531)。支原体肉汤基础CM403、支原体添加剂-G SR0059(BD公司，货号：255420)。

1.3 实验动物及分组 BALB/c雄性小鼠30只，体质量(18±2)g，3周龄，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016]，检疫后备用。SPF级动物房，正常组与模型组隔离饲养，自由摄取标准颗粒饲料和水，适应性饲养3 d后进行实验。采用随机数字表法分为正常组、MP模型组、虎杖提取物组，每组10只。

1.4 主要试剂及仪器 小鼠肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponinI，cTnI)、肌红蛋白(myoglobin，Mb)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)ELISA试剂盒(XY-Biotechnology，批号：2018060114)；MP核酸检测试剂盒(达安基因，货号：Cat，#DA-D064)；酶标仪(北京普朗新技术公司，货号：DNM-9602)；Real-time检测仪(ABI，货号：ABI-7300)。

1.5 支原体菌液培养 将MP菌株接种至支原体肉汤培养基，置于恒温培养箱内培养5～7 d，当菌液颜色由暗红色变成均匀一致的黄色时收获MP菌液，采用颜色变化单位(CCU)方法测定MP浓度，调整浓度至1×107CCU/mL，作为工作菌液。

1.6 造模及给药方法 正常组用50 μL生理盐水滴鼻，MP模型组和虎杖提取物组均用50 μL支原体菌液(菌液浓度为1×107CCU/mL)滴鼻感染BALB/c小鼠，连续3 d。治疗从感染第1天开始。正常组和MP模型组以生理盐水0.25 mL/20 g灌胃，虎杖提取物组0.25 mL/20 g灌胃，连续3 d。

1.7 标本采集及检测 第4天处死取材，小鼠摘眼球取血，8 000 r/min离心，取上清液，用MP核酸检测试剂盒检测MP感染情况，结果阳性即MP造模成功。造模成功则检测小鼠血清中CK-MB、cTnI、Mb和AST的水平。

2 结果

2.1 各组小鼠血清MP-DNA定量比较 见表1。

表1 各组小鼠血清MP-DNA定量比较

注：与MP模型组比较，aP<0.01。

表1结果表明，正常组MP-DNA基因拷贝数显示无MP感染，而模型组有MP感染，表明造模成功；与MP模型组相比，虎杖提取物组的MP-DNA含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 各组小鼠血清CK-MB、cTnI、Mb、AST水平的比较 见表2。

表2 各组小鼠血清CK-MB、cTnI、Mb、AST水平的比较

注：与正常组比较，aP<0.01；与MP模型组比较，bP<0.01。

表2结果表明，与正常组相比，MP模型组小鼠血清中CK-MB、cTnI、Mb、AST的水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与MP模型组相比，虎杖提取物组小鼠血清中CK-MB、cTnI、Mb、AST的水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

现代医学认为，支原体肺炎合并心肌损伤与感染、免疫因素有关，其致病机制主要有：MP直接侵入，MP进入血液粘附于血管内皮细胞上，使血管通透性增加，炎性细胞浸润心肌间质，能诱导炎性细胞产生细胞因子，主要有白细胞介素-1、-6、-2，肿瘤坏死因子α，γ干扰素，导致心肌炎；MP抗原与人体心、肺等组织存在着部分共同抗原，感染后可产生相应组织的自身抗体，形成免疫复合物，导致心肌的免疫损伤[3]；MP感染时肺部组织损伤，肺泡内气体交换面积减少，导致机体缺血缺氧，氧自由基增多，超氧化物歧化酶活性减低，清除能力下降；IgE与外周血嗜酸性粒细胞增高，从而导致细小支气管管腔狭窄或闭塞引起心肌缺氧损伤[4]。

儿童支原体肺炎的中医病机主要为肺络痹阻，因外感温热毒邪入肺络，导致肺气郁闭，血行迟滞、络脉失养，进一步加重热毒、痰湿、血瘀，三者互结阻于络中，络脉长期滞塞不通易导致络脉气血阴阳的损伤，形成虚实夹杂之证[5]。若感邪较重或正不胜邪，病情进展，则可由肺而累积他脏。若邪热炽盛，内陷厥阴，引动肝风，则出现高热、神昏、抽搐等邪陷厥阴之变证；甚或因心失所养，心气不足，心阳虚衰，而出现面白肢冷，呼吸急促，烦躁不安，脉微欲绝等危重之象[6]。

目前，关于支原体肺炎合并心肌损伤的病机尚未达成统一的认识，众多医家根据自身的临床经验，从不同的角度进行深入探讨，多数认为是热、痰、瘀互结所致。我团队从“肺络”理论研究支原体肺炎已近10年，我们认为，肺之气络不利则不能推动血行，致肺之血络壅滞，必然影响心络。心之气络和脉络相互协调，才能维持心脏正常的搏动频率和节律，推动血液循脉管周行全身，同时向心脏自身供血。心之气络郁滞，则心脏搏动频率和节律改变，心脏收缩泵血功能异常，出现早搏，心动过速等；心之脉络瘀阻，则心脏自身血液供应障碍，失于濡养，出现心肌受损。临床报道支原体肺炎患儿出现心肌损害的病例不断增加，与心之气络脉络损伤有关[5]。

虎杖(Polygonum cuspidatumSieb.Et Zucc)性味苦、酸，微寒，归肝、胆、肺经，具有祛风利湿、清热解毒、散瘀定痛、止咳化痰功效。现有资料表明其有效成分药理活性丰富，包括抗炎、抗菌、抗病毒、改变血流变、扩张血管、保护心肌、调血脂、抗血栓、抗氧化、抗肿瘤等多种作用[7]。研究发现在氧糖剥夺/再复氧条件下，虎杖苷提高了H9C2细胞的存活率，同时其可以激活JAK-STAT3信号通路，从而对心缺血再灌注损伤起到保护作用[8]。虎杖苷还能够下调急性心肌梗死后大鼠血清中乳酸脱氢酶、CK-MB、肌酸激酶的水平，减少心肌梗死面积，调节心脏功能，减轻急性心肌梗死后心肌损害的程度，并推测其机制可能由Nrf2/HO-1通路的激活介导[9]。虎杖苷可显著抑制心肌细胞缺血后纤维化和细胞凋亡的病理进程，并且对急性心肌梗死后的心律失常及心脏功能有显著的改善[10]。针对MP感染后合并心肌损伤，我们认为是痰瘀阻络，本研究选用的虎杖活血散瘀，祛风通络，且能止咳化痰，在清肺化痰的同时，通络养心，采用化痰通络法治疗，以期收到良好的疗效。

CK-MB是心肌特异性同工酶，在心肌中含量最高，对判断心肌损害具有高度特异性。当心肌受到损伤时，CK-MB会释放到外周血，导致外周血CK-MB水平增高，并且不到24 h即可达到峰值，恢复到正常的时间在3～4 d内[11]。有研究报道，通过CK-MB检测，可判断重症肺炎患儿是否并发心肌损伤及预后情况。因此，血清CK-MB可作为肺炎心衰的早期诊断指标之一[12]。

肌钙蛋白是调节心肌与横纹肌收缩的相关蛋白，肌钙蛋白共有T、C、I三个亚基，和原肌球蛋白一起调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。cTnI对心肌具有高度的特异性和灵敏度，目前已成为医学研究中最理想的心肌梗死标志物。但对于这一指标，国内外成年人研究较多，但儿童研究较少。cTnI仅存在心肌中，当心肌细胞膜完整时，cTnI不能进入血循环，故健康人外周血检测不到cTnI；只有心肌细胞缺血缺氧发生变性坏死时，细胞膜不完整，cTnI进入血循环，才能检测到。有研究表明，cTnI水平与心力衰竭严重程度呈正相关，可作为心力衰竭的病情监测指标，评估小儿急性心力衰竭时心肌损伤的程度[13]。

Mb是心肌和骨骼肌中合成的一种含有亚铁血红素的低分子蛋白。当心肌细胞受损时可较早地影响细胞膜结构和功能缺陷，导致心肌Mb漏出而释放至血液中。由于其能够较早的释放于血液中，因此Mb的灵敏度高，在评价心肌损伤及诊断、鉴别诊断中具有一定价值[14-15]。

心肌酶在反应心肌细胞完整性上具有极高灵敏性，AST是心肌内众多的酶类之一。研究发现AST与肺炎严重程度存在显著的正向直线相关关系，其升高的程度与心肌的损伤程度成正比，检测AST可及早发现心肌损伤的程度，表明血清心肌酶在小儿肺炎诊断工作中具有较高价值[16]。并且，新生儿肺炎无论是轻症、重症，还是急性期、恢复期的心肌酶指标相比健康新生儿均有明显的升高，提示新生儿在肺部感染发生后常会造成其心肌细胞炎症浸润及受损，临床医生可依据心肌酶的变化及时调整治疗方案[17]。

本研究表明，虎杖提取物有抗MP的作用，且MP感染后小鼠血清中心肌损伤标志物包括CK-MB、cTnI、Mb、AST的水平均明显升高，而虎杖提取物组各指标表达均下降显著，提示虎杖能够改善MP感染引起的心肌酶谱异常。

综上所述，虎杖提取物对防治支原体感染合并心肌损伤，保护患儿心脏功能，改善预后有积极的临床意义。