雪上一枝蒿总生物碱抗关节炎作用机制研究*

罗成月，陈晓兰，杨敬洪，杨晓梅

(贵阳中医学院 药学院，贵州 贵阳 550002)

雪上一枝蒿是毛茛科植物短柄乌头AconitumbrachypodumDiels、铁棒锤A.pendulumBusch及宣威乌头A.subrosullatumH. -M.的干燥块根[1]，为云南、贵州等地民间习用治疗风湿疼痛、关节炎、跌打损伤的要药之一，药理实验已证明其具有镇痛、抗炎作用[2]。但是在治疗关节炎方面并未见报道。本实验从抗炎角度，成功建立了大鼠足肿胀动物模型，通过观察大鼠后足的红肿情况，并检测前列腺素、环氧合酶的含量，探讨雪上一枝蒿总生物碱抗关节炎的作用机制，为其临床治疗关节炎症提供理论和实验依据。

1 材料

1.1 动物

SD雄性大鼠，SPF级，体重量200±20g；购买于重庆腾鑫生物科技有限公司，合格证号：SCXK-(军)2012-0011。

1.2 药品与试剂

复方地塞米松软膏(国药集团三益药业有限公司，批号：H34020304) 雪上一枝蒿总生物碱(自制，纯度61%)；角叉菜胶(Sigma公司，批号：G1013-05G)；乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160425)；ELISA试剂盒(上海科琳生物有限公司)

2 方法

2.1 对关节炎大鼠足肿胀度的影响

选取SD雄性大鼠，体重为180～220 g，随机分为6组，分别为空白对照组，阳性对照组，模型组，雪上一枝蒿总碱溶液高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只。适应一星期以后，采用先给药在造模的方法，空白组不给药也不致炎，模型组不给药，阳性组大鼠于左后足跖处涂擦复方地塞米松，大鼠给药量为0.18～0.4 cm/d，雪上一枝蒿总碱溶液高剂量组、中剂量组、低剂量组大鼠于左后足跖分别涂擦质量浓度为151 mg/mL、75.7 mg/mL、37.75 mg/mL的雪上一枝蒿总碱乙醇溶液；给药量为每只0.2 mL，每天两次，连续给药7天，末次给药1 h后用1%的角叉菜胶于大鼠左后足跖中心进行皮下注射致炎，同时再给药一次，用游标卡尺分别测定给药后1 h、2 h、4 h、6 h的足爪厚度，肿胀程度用造模后容积-造模前容积的差(mL)表示，计算足肿胀度。

2.2 对大鼠关节炎前列腺素E2(PGE-2)含量的影响

按2.1.1方法建模测定足肿胀度以后，处死大鼠，切下左后足趾，用10%甲醛溶液低温浸泡，剪碎，离心，取组织液酶免疫测定法(EIA)测定炎足足跖部的渗出液前列腺素E2(PGE-2)的含量。

2.3 对大鼠关节炎足爪组织环氧合酶-2(COX-2)的影响

按2.1.1方法建模测定足肿胀度以后，处死大鼠，切下足趾，用10%的甲醛溶液低温浸泡，免疫组织化学法(IHC)检测角叉菜胶致炎大鼠足爪组织环氧合酶-2(COX-2)的表达情况。用IPP图片处理软件分析阳性颗粒的表达情况，用平均光密度表示(MOD)。

3 结果

3.1 对大鼠关节炎足肿胀度的影响

本实验成功建立角叉菜胶致炎模型，采取先给药再造模的方式，造模后再给药治疗一次。实验前每组大鼠足爪正常无红肿现象，实验期间空白组大鼠的行动性、反应性、毛发色泽均正常。致炎后模型组，复方地塞米松阳性组，雪上一枝蒿总碱高、中、低剂量组左后足开始出现红肿现象，行动缓慢，给药后左后足足爪在1～4 h内红肿明显，6 h时除空白组外各组大鼠红肿开始明显减弱。

图1 大鼠足肿胀特征Fig. 1 Characteristics of rat paw swelling

由表1可知，与空白组比较，各组大鼠造模并给药后足爪都出现红肿；与模型组对照，阳性组足趾厚度显著低于模型组，雪上一枝蒿总碱高、中剂量组在1 h内足肿胀也显著性降低；4 h时雪上一枝蒿总碱中、低剂量组足趾厚度显著降低，高剂量组也降低，但降低不明显；6 h时，雪上一枝蒿总生物碱中剂量组足趾厚度显著降低，高、低剂量组也有降低，但降低不明显。

表1 对足肿胀度的影响

注：与空白组比较#p值<0.05；与模型组比较*p值<0.05。

3.2 对大鼠关节炎前列腺素E2的影响

由表2可知，与空白组比较，其余各组足爪组织中的前列腺素E2的含量显著增加；与模型组比较，各组的前列腺素E2的含量均显著降低。

表2 雪上一枝蒿总碱对大鼠前列腺素E2(PGE2)含量的影响

注：与模型组比较*P值<0.05；与空白组比较#P值<0.05。

3.3 对大鼠关节炎环氧合酶的影响

本实验采用酶免疫法测定环氧合酶COX-2的表达情况，大鼠踝关节中COX-2的表达情况见图2。

由图2可知，各组大鼠足爪组织中环氧合酶的表达，其中模型组有大量的棕色染色细胞的表达，与模型组比较，阳性组和雪上一枝蒿总碱高、中、低3个给药剂量组的棕色染色细胞明显减少。由表3可知，与模型组比较，其他各组的平均光密度明显降低，与空白组比较，阳性组与高剂量组的平均光密度值没有显著性差异，模型组，中、低剂量组的平均光密度值显著升高。

表3 对大鼠环氧合酶的影响

注：与模型组比较*P值<0.05；与空白组比较#P值<0.05。

图2 大鼠踝关节中COX-2的表达情况Fig. 2 Expression of COX-2 in the ankle joint of rats

4 讨论

雪上一枝蒿总生物碱具有确切的抗炎、镇痛作用，本文结果表明，雪上一枝蒿总生物碱能明显抑制角叉菜胶所引起的大鼠足肿胀程度，与模型组对比，高、低剂量组在6 h时足肿胀有较少的降低，可能是由于实验动物的差异造成的，在治疗后6 h时阳性

组与中剂量给药组的足肿胀显著性降低，其中阳性组比模型组降低了1.95倍，中剂量组比模型组降低了1.77倍，阳性组、中剂量组的抗炎效果较佳。雪上一枝蒿总生物碱能显著性抑制环氧合酶-2(COX-2)在炎症中的表达，能显著抑制前列腺素E2(PGE-2)的合成，其中，阳性组PGE-2的含量比模型组降低了2.15倍，高剂量组PGE-2的含量比模型组降低了1.78倍，中、低剂量组PGE-2的含量降低没有阳性组和高剂量组明显。说明雪上一枝蒿总生物碱抗关节炎作用机制可能与抑制环氧合酶-2的表达，减少PGE-2的合成有关。