贵州特色饮片醋炙荷叶质量标准研究*

王先菊，李 玮，杜洪志，吴珊珊，候晓杰，魏 晴，刘娅琴，张 敏

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

荷叶为睡莲科植物莲NelumbonuciferaGaertn.的干燥叶，具有清暑化湿、升发清阳、凉血止血等功效；可用于暑热烦渴，暑湿泄泻，脾虚泄泻，便血崩漏[1]等。现代研究表明，荷叶有多种化学成分及药理作用；化学成分包括黄酮类、生物碱类、挥发油类、三萜类、类固醇、酚酸类等[2-3]，其中，前两者是其主要活性成分[4]，其药理作用主要有降血脂、减肥作用[5-6]，抑菌作用[7]，抗惊厥作用，止血作用[8]，抗氧化作用[9]等。荷叶价格低廉，产量丰富，具有很好的前景，目前在2015版《中国药典》中，只收载了荷叶以及荷叶炭，醋荷叶未见收载，缺乏其质量控制方法，而醋炙荷叶又为贵州特色炮制方法，因此本研究对贵州特色炮制方法饮片醋炙荷叶进行质量标准研究，为醋炙荷叶的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(岛津LC-20AT型高效液相色谱仪)；万分之一电子分析天平(ME204型上海梅特勒托利多仪器有限公司)；超声波清洗机(HS10260D型天津恒奥科技发展有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-2型常州奥华仪器有限公司)；鼓风干燥箱(CS101-1C型重庆四达实验仪器厂)；十万分之一电子天平(AUW220D苏州岛津仪器有限公司)。

1.2 试剂

荷叶碱(CAS NO:475-83-2，纯度：≥98，贵州迪大生物科技有限责任公司)，乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司色谱纯)，水(杭州娃哈哈集团有限公司授权贵阳娃哈哈昌盛饮料有限公司制造)，冰醋酸(天津市凯信化学工业有限公司)，三乙胺(天津市富宇精细化工有限公司)，甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司色谱纯)，乙醇(天津市富宇精细化工有限公司分析纯)。

1.3 试药

经过实地采购和网上选购以及厂家提供，得到江西、浙江、广西、河南、湖北、山东、广东、贵州、四川、湖南等10个地方的药材，药材来源见表1，由贵州中医药大学药学院生药教研室魏升华教授鉴别为睡莲科Nymphaeaceae荷叶属莲NelumbonuciferaGaertn的干燥叶。醋炙荷叶饮片出自德昌祥的妇科再造丸，即：称取适量荷叶于适宜容器内，加入与荷叶质量比例为100∶20的米醋，闷润1 h，每0.5 h翻动一次，置炒制容器内炒至近干，取出，放凉。

表1 药材来源

2 方法与结果

2.1 检查

2.1.1 水分测定

照2015版《中国药典》第四部通则0832项下“水分测定法”烘干法测定醋炙荷叶饮片的水分含量，对10批荷叶饮片及醋炙荷叶饮片进行测定，10批醋炙荷叶饮片水分范围为4.39%～9.86%，平均值为7.17%。

2.1.2 总灰分测定

按照2015版《中国药典》第四部通则2302项下“灰分测定法”测定醋炙荷叶饮片的灰分含量，对10批荷叶饮片及醋炙荷叶饮片进行测定，10批醋炙荷叶饮片灰分范围为6.58%～9.51%，平均值为8.58%。

2.2 浸出物测定

照2015版《中国药典》第四部通则2201项下“浸出物测定法”，以70%乙醇为溶剂，按热浸法测定醋炙荷叶饮片的醇浸出物含量，对10批荷叶饮片及醋炙荷叶饮片进行测定，10批醋炙荷叶饮片浸出物范围为8.52%～13.46%，平均值为10.56%。

2.3 荷叶碱测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱WondaSil C18-WR(4.6 mm×250 mm，5 μm) ；以乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(27∶70.6∶1.6∶0.78)为流动相；检测波长为270 nm；流速为1.000 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。

2.3.2 对照品的制备

取荷叶碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含16 μg的溶液，即得。

2.3.3 供试品的制备

精取本品粗粉0.5 g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定重量，加热回流2.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.3.4 线性关系考察

取“2.3.2”项下配制的对照品，精密吸取对照品溶液0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件，分别进样20 μL，记录峰面积，以浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得Y=67103X-997.45(r= 0.9997)，结果表明荷叶碱呈良好线性关系，线性范围为0.016～0.176 μg。

2.3.5 精密度实验

取编号为SC2017072的荷叶的粉末，按要求提取，连续进样6次，计算RSD值，测定荷叶碱的RSD值为2.5%，小于3%，说明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性实验

精密称取SC2017072的荷叶药材粉末6份，每份0.5 g，按“2.3.3”项下制备供试品溶液，再按2.3.1项下色谱条件进行测定，测得RSD值为2.5%，说明重复性良好。

2.3.7 稳定性实验

取编号为SC2017072的荷叶，按“2.3.3”项下制备供试品溶液，将其置于避光的室内，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h测定，测得荷叶碱平均峰面积的RSD值为2.45%，表明供试品在12 h内稳定。

2.3.8 加样回收实验

称取已知含量的生品荷叶(SC2017072)粉末(过2号筛)0.25 g，精密加入与0.25 g中荷叶中荷叶碱含量相同的对照品溶液(16 μg/mL)9.2 mL，测得回收率的范围在96.05%～103.33%之间，且RSD值为2.9%，说明此方法可行。

2.3.9 样品荷叶碱含量测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定含量结果见表2。

表2 荷叶碱的测定

续表2

产地样品序号百分含量/%平均百分含量/%RSD湖南10.051620.04930.05130.05062.81%江西10.074220.075430.07520.0750.86%山东10.029920.031230.03140.03082.65%四川10.078420.077330.07910.07831.16%浙江10.050120.050230.05020.05020.14%

结果表明，10个批次醋炙荷叶饮片的荷叶碱含量范围在0.0300%～0.0851%之间，含量平均值为0.06%。

3 结果与讨论

本次实验测定了江西、浙江、河南、湖北、广东、四川、广西、山东、贵州、湖南等产地10个批次荷叶的水分、灰分、浸出物、荷叶碱等项目。经计算，各地区所产荷叶，经醋炙后水分与生品比较大多有所减少，减少量在3%以上，分别是江西3.28%、浙江8.18%、河南3.08%、湖北3.62%、广东3.57%、四川3.45%。而有3个地区水分减少在1%以下，分别是广西0.95%、山东0.73%、贵州0.44%。另外湖南地区的水分含量略微增加，可能是该地区荷叶中含水量较少，在经过醋的浸润炒制后水分减少不明显，而冷却过程中有水汽的加入，从而使水分略微增加。总灰分的测定中，生品与醋炙品比较，炮制前后总灰分含量变化趋势并不明显，既有增加也有减少，可能因为荷叶的收集是在不同的时间和不同地区所收集的，因此，存在储存时间长短的问题，储存时间较长的荷叶有的有效成分慢慢减少，所以使灰分含量增加。浸出物的检测中，江西、河南、湖北的含量增加，其余7个地区的含量减少，其原因可能是浸出物中含有多种成分，如生物碱类、黄酮类、挥发油类以及多糖和有机酸等成分，而炮制过程会使部分成分减少，从而使浸出物含量减少，另外在荷叶碱的检测中，山东、四川、湖南、湖北地区含量增加，其余6个地区含量亦有减少，本次研究测定了炮制前后水分、总灰分、浸出物、指标成分荷叶碱等含量的变化情况，有数据支持，可为贵州特色炮制方法醋炙荷叶饮片质量控制提供参考。由于实验不能详细说明炮制影响各类成分变化的机理，因此有待进一步研究。

醋炙荷叶贵州特色炮制方法饮片质量标准的拟定：上限标准按平均值的20%上浮，建议醋炙荷叶贵州特色饮片的水分不超过8.61%，总灰分不超过10.30%，下限标准按平均值20%下浮，建议醇浸出物不得少于8.45%，荷叶碱含量不得少于0.05%。