环状RNA Amotl-1在先兆早产患者中的表达及与阴道黏膜免疫微环境的相关性研究

徐晖，贺艺，张幼林

(湖北科技学院附属第一医院 咸宁市中心医院产科，湖北 咸宁 437000)

近年来，随着我国二胎政策的全面开放，先兆早产发生率呈上升趋势，影响母婴健康[1]。世界卫生组织将妊娠周数<37周分娩作为早产的诊断标准，我国的早产定义为妊娠满28周至不足37周分娩者，且先兆早产的确诊条件为：①妊娠在28～37周；②胎膜完整；③宫口开大3 cm以内；④子宫收缩持续时间不超过30 s、间隙为10 min以上者。先兆早产病因复杂，与胎膜早破、绒毛膜羊膜炎、下生殖道及泌尿系感染、妊娠合并症和并发症、子宫畸形等有关[2-3]。环状RNA是一种特殊的非编码RNA分子，与传统线性RNA不同，环状RNA分子呈封闭环状结构，且不受RNA外切酶的影响，表达相对稳定，富含多个功能结合位点，能解除微RNA(microRNA，miRNA)对其靶基因的作用，亦可与疾病miRNA相互作用，发挥调控作用[4-5]。先兆早产的原因较多，多数由于阴道菌群失衡导致生殖道上行感染引起，但是具体机制尚未阐明[6-7]。本研究旨在探讨环状RNA Amotl-1在先兆早产患者中的表达及与阴道黏膜组织免疫微环境的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年8月至2018年10月在咸宁市中心医院就诊的82例先兆早产患者作为观察组，年龄22～36岁，平均(30±4)岁；孕周28～37周，平均(29.6±1.2)周，其中初产妇48例，经产妇34例。选择同期71例门诊正常孕检妊娠女性作为对照组，年龄21～37岁，平均(30±4)岁；孕周28～37周，平均(31±1.3)周；其中初产妇46例，经产妇25例。两组受试者年龄、孕周比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2观察组纳入与排除标准 纳入标准：①根据《妇产科学(第5版)》[8]先兆早产诊断标准，经腹部超声、生化指标检查确诊；②孕周<37周，停经后伴少量阴道出血，有腰痛、下腹坠痛症状；③意识清楚，可正常交流者。排除标准：①合并胎盘早剥、胎儿宫内发育缓慢、宫内感染者；②既往有出血史、精神异常、甲状腺功能异常者；③给予其他药物治疗或影响本研究检测结果者。

1.3仪器与设备 本研究使用的仪器和设备为石蜡切片机[徕卡显微系统(上海有限公司，型号：RM2245)]、电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗仪器厂，型号：101-2)、生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司，型号：BSC11A1802105)、BCA蛋白定量试剂盒(中国碧云天生物技术研究所，批号：20170463)、7500聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)基因扩增仪(美国ABI公司，型号：7500型)、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司，批号：20185142)、紫外分光光度仪(日本Olympus公司)、电泳仪BIO/RAD-3000(深圳市宇德立生物科技有限公司)、高度冷冻离心机(日本久保田，型号：5910型)。

1.4方法

1.4.1标本采集 通过刮片获取阴道黏膜上皮细胞，并进行常规培养，备用；测定环状RNA Amotl-1表达水平。①RNA提纯。依次将500 μL Trizol和经细胞破碎机获得的均匀溶浆加入细胞标本中，随后在1.0 mL离心管中振荡后，常温静置5 min；再向离心管中加入氯仿200 μL，连续进行15 s剧烈振荡，静置5 min后以离心力1 216×g离心15 min；取1.5 mL上清液置于离心管中，并加入两倍体积异丙醇，24 h后在离心力1 216×g，室温4 ℃条件下离心10 min，去除上层清液，加入75%乙醇1 mL预冷，离心5 min，离心力3 258×g；离心后去除上清液及多余乙醇，常温干燥7 min，利用紫外分光度仪检测RNA浓度并完成RNA提纯(以Rnase作为空白对照)，在A260下测定吸光度值；采用Dnase酶处理RNA，随后放入冰箱[9-10]。②检测方法。采用实时荧光PCR检测不同阴道黏膜上皮细胞中环状RNA Amotl-1表达水平。引物设计：β-actin FOR 5′GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG 3′,RE 5′ATGCCACAGGATTCCATACC 3′；环状RNA Amotl-1 FOR 5′CAGGATGCAGCAGGTGGAAGC 3′,RE 5′TGCTCCAGGCTGTAGTCTGTGG 3′。实时荧光PCR反应条件为：30 ℃下连续进行10 min；42 ℃下进行30 min；99 ℃下进行5 min；5 ℃下进行5 min，共完成35个循环，72 ℃下完成10 min延长，将所获得的扩增产物放入1.5%琼脂凝胶中电泳，随后采用UVP凝胶图像测定灰度值，β-actin作为内对照。

1.4.2阴道黏膜免疫微环境测定 测定阴道黏膜pH值以及阴道人防御素5(human defensin 5，HD-5)、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)、分泌型IgA(secretory IgA，sIgA)表达水平。充分暴露阴道后，取后穹隆阴道分泌物，采用pH试剂测定pH值；使用0.9%氯化钠注射液冲洗内1/3阴道壁，灌洗液常规离心后采用酶联免疫吸附法测定阴道HD5、IgE、sIgA、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)及白细胞介素(interleukin，IL)-10水平。

1.5观察指标 比较两组患者的环状RNA Amotl-1表达水平及阴道黏膜免疫微环境水平(pH值、阴道HD5、IgE、sIgA、IFN-γ、IL-10)，分析先兆早产患者环状RNA Amotl-1水平与阴道黏膜免疫微环境的相关性。

2 结 果

2.1两组环状RNA Amotl-1表达水平比较 观察组环状RNA Amotl-1表达水平高于对照组(0.86±0.16比0.07±0.01)(t=5.315，P<0.001)，见图1。

PCR：聚合酶链反应；a：先兆早产实时荧光PCR图片；b：正常妊娠实时荧光PCR图片

图1 两组实时荧光PCR图(×300)

2.2两组阴道黏膜免疫微环境水平比较 观察组阴道pH值以及阴道HD5、IgE、sIgA水平均高于对照组(P<0.01)，IFN-γ及IL-10水平低于对照组(P<0.01)，见表1。

2.3先兆早产患者环状RNA Amotl-1水平与阴道黏膜免疫微环境的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，先兆早产患者环状RNA Amotl-1水平与阴道黏膜免疫微环境中的阴道pH值以及阴道HD5、IgE、SIgA水平呈正相关(r=0.563，P=0.002；r=0.612，P=0.019；r=0.668，P=0.035；r=0.598，P=0.043)，与IFN-γ及IL-10水平呈负相关(r=-0.643，P=0.039；r=-0.611，P=0.043)。

组别例数pH值阴道HD5(ng/L)IgE(μg/L)sIgA(mg/L)IFN-γ(μg/L)IL-10(μg/L)对照组713.06±0.368.74±1.09164.34±19.4637.26±0.958.32±1.122.16±0.69观察组824.13±0.6912.48±3.51334.69±23.6353.12±1.324.59±0.691.64±0.45t值6.3925.3189.3855.4257.2214.539P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

HD5：人防御素5；IgE：免疫球蛋白E；sIgA：分泌型免疫球蛋白A；IFN-γ：γ干扰素；IL-10：白细胞介素-10；对照组：正常孕检妊娠妇女；观察组：先兆流产患者

3 讨 论

目前，先兆早产的临床诊断主要根据患者病史和临床表现，存在明显的局限性。研究表明，RNA是DNA与编码蛋白之间的信使，亦是经典RNA测序方法中的特征性分析，能准确反映胎儿的生长情况，为临床诊疗提供更丰富的信息。采用实时荧光PCR技术测定环状RNA Amotl-1水平的研究表明，先兆早产患者环状RNA Amotl-1表达水平较健康孕检孕妇高[9-10]，本研究结果与其一致。环状RNA Amotl-1是一类特殊的非编码RNA，除具有RNA的特性外，还可以竞争方式进行自我调控，维持基因水平的稳定[11-12]。研究表明，环状RNA Amotl-1是环状RNA的重要组成部分，能通过碱基互补配对等方式直接调控环状RNA Amotl-1转录，亦可与miRNA相互作用促进环状RNA Amotl-1降解，能直接参与先兆流产的发生发展[13-14]。另有研究发现，先兆早产患者的环状RNA Amotl-1主要定位于细胞质，其表达水平较高，并可与miR-7相互结合，发挥协同作用，提高miRNA的表达水平[15-16]。

先兆早产与阴道微环境的联系紧密。下生殖道病原微生物上行感染是引起先兆早产的主要原因[17]。阴道pH值在生殖道感染诊断中具有较高的敏感性，正常妊娠期女性阴道pH值较正常非孕女性阴道pH值(3.8～4.2)下降，但先兆早产患者阴道pH值反而升高，可能与机体激素水平异常有关。阴道唾液酶能产生毒性因子，可提高细菌黏着力，引起黏蛋白破坏，促进细菌穿过宫颈黏液，导致先兆早产的发生率升高[18]。阴道黏膜中大量的sIgA是阴道重要的免疫球蛋白，能发挥良好的免疫防御作用；HD5是阴道上皮的先天免疫因子，在先兆早产患者中呈高表达，能直接杀死病原微生物。IFN-γ是水溶性二聚体细胞因子，主要由活化的T细胞及自然杀伤细胞产生，能发挥抗病毒、免疫调节作用；IL-10能直接参与机体细胞的生长、分化，亦可参与机体炎症与免疫反应，其表达水平与消化、血液等疾病有关。本研究中，观察组阴道pH值以及阴道HD5、IgE、sIgA水平均高于对照组，IFN-γ及IL-10水平低于对照组(P<0.01)，表明先兆早产患者伴有阴道黏膜免疫功能紊乱，并与先兆早产相关。先兆早产的发生发展与阴道免疫环境有关，易受到多种因素的影响，但目前对环状RNA Amotl-1水平与阴道黏膜免疫微环境关系的研究较少。本研究中，先兆早产患者环状RNA Amotl-1水平与阴道黏膜免疫微环境阴道pH值以及阴道HD5、IgE、sIgA水平呈正相关，与IFN-γ和IL-10水平呈负相关，说明环状RNA Amotl-1与先兆早产患者阴道黏膜免疫微环境存在明显相关性。研究表明，阴道黏膜免疫微环境能直接参与先兆流产的发生，而环状RNA Amotl-1水平也可影响阴道黏膜免疫微环境，导致恶性循环形成，加剧疾病的发生、发展[19]。因此，临床对于疑似先兆早产患者应加强环状RNA Amotl-1及阴道黏膜免疫微环境相关指标的检测，以早期确诊，为临床诊疗提供依据和参考。对于已经确诊的先兆早产患者，应加强患者药物指导、干预，避免延误最佳诊疗时机[20-21]。

综上所述，先兆早产患者中环状RNA Amotl-1与阴道黏膜免疫微环境相关，临床应加强相关指标检测，为早期临床诊疗提供帮助。