变应性支气管肺曲霉病患者中CFTR基因变异种类分析

王泽双，刘雅萍，田欣伦，支玉香

(中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院 a.变态反应科，b.基础医学研究所医学遗传学系,c.呼吸内科，北京 100730)

变应性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)是机体对存在于支气管内的曲霉菌(主要为烟曲霉)产生免疫应答的一种疾病，在部分特发性哮喘和囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)患者中也普遍存在对烟曲霉敏感的情况，然而仅有2.5%的哮喘患者和9%的CF患者发展成ABPA[1-2]。ABPA患者在临床常表现为难以控制的哮喘、肺部浸润及中央型支气管扩张等，其症状和体征与哮喘和CF相似，临床易引起误诊或漏诊[3]。有研究报道，高达1/3的ABPA患者被误诊为肺结核、哮喘等疾病[4]。自1952年首例ABPA报道以来[5]，国内外学者对ABPA的发病机制进行了广泛研究。其中，基于囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)基因多态性与ABPA发病之间的关系成为近年的研究热点。正常情况下，CFTR基因编码一种名为CFTR的跨膜糖蛋白，其主要功能是维持上皮细胞内外的水电解质平衡。CFTR的功能异常可导致氯离子转运障碍，表现为慢性鼻窦炎、咳嗽、喘息等呼吸系统症状及汗液咸度异常和精子排除不畅等[6]。CF是一种常染色体隐性遗传病，常见于高加索人，新生儿中CF的发病率约为1/3 500[7-8]。有研究表明，我国CF患者中检测到的CFTR基因变异与高加索人有很大差异[9-15]。国外有文献报道，ABPA患者携带CFTR基因变异的比例高于哮喘人群[16]。本研究旨在探讨我国ABPA患者CFTR基因变异的特殊性，以及CFTR基因变异在改变ABPA患者临床症状及体征中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2010年1月至2018年12月于北京协和医院呼吸内科及变态反应科门诊确诊的9例汉族ABPA患者作为研究对象，ABPA诊断标准参照2017年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组编制的《变应性支气管肺曲霉病诊治专家共识》[17]，具体如下。①相关疾病(至少符合1条)：哮喘、支气管扩张症、慢性阻塞性肺疾病、非囊性纤维化等。②必需条件(2条均符合)：血清烟曲霉特异性IgE水平升高(>0.35 kUA/L)或烟曲霉皮试速发反应阳性；血清总IgE水平升高(>1 000 U/mL)。③其他条件(至少符合2条)：外周血嗜酸粒细胞大于0.5×109/L(使用激素者可正常，以往的数据可作为诊断条件)；影像学与ABPA一致的肺部阴影(一过性病变包括实变、结节、牙膏征或指套征、游走性阴影等，持久性病变包括支气管扩张、胸膜肺纤维化等)；血清烟曲霉特异性IgG或沉淀素阳性。所有患者无不孕不育病史，出生后无肠梗阻、直肠脱垂等消化道症状，其中4例患者经汗液电解质检查氯离子水平正常，排除CF。本研究经中国医学科学院北京协和医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2试验方法 所有患者采集外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，使用DNA抽提试剂盒(QIAGEN KIT)提取DNA；使用Nanodrop紫外分光光度计对所提取的DNA进行浓度和纯度检测，要求浓度达到30 ng/μL以上，纯度在吸光度(A)260/280下为1.8～2.0，-20 ℃ 保存备用。

从NCBI数据库下载CFTR基因序列，使用Primer3(Version 0.4.0)软件设计引物并进行验证，并经过NCBI-BLAST检测特异性，委托北京天一辉远生物科技有限公司设计引物。聚合酶链反应试剂包括Taq酶(PrimeSTAR GXL)、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液等，购自日本TAKARA公司。聚合酶链反应条件：变性98 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 3 min，×35循环，16 ℃保温。聚合酶链反应扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的条带需清晰无杂带，浓度>30 ng/μL为合格样品，委托北京天一辉远生物科技有限公司进行Sanger测序。

在NCBI数据库中查找CFTR基因序列信息，并结合本研究案例采用Chromas Pro 2.1.3软件对CFTR基因序列进行读图分析。

2 结 果

2.1一般资料分析 本研究纳入9例ABPA患者进行基因筛选，其中男4例，女5例，年龄31～67岁，中位年龄为48岁。所有患者均为汉族且无ABPA家族史及血缘关系。本研究中ABPA患者的临床表现以呼吸系统症状为主，其中哮喘6例，咳嗽9例。3例ABPA患者肺功能检查，第一秒用力呼气量/用力肺活量比值降低。胸部高分辨CT发现，肺部条索状影、管壁增厚等支气管扩张表现患者4例。9例ABPA患者的一般资料及CFTR基因变异类型见表1。

2.2CFTR基因变异结果分析 本研究9例患者均利用普通聚合酶链反应及Sanger测序进行了CFTR基因区域的全外显子测序，其中9例患者均携带CFTR基因变异，且所发现的CFTR基因变异均不是国外常见变异类型。在9例患者中，共发现c.1408G>A(图1)、c.2562T>G(图2)、c.374T>C(图3)及c.1666A>G(图4)4种变异类型。

表1 9例ABPA患者的一般资料及CFTR基因变异类型

ABPA：变应性支气管肺曲霉病；CFTR：囊性纤维化跨膜转导调节因子

CFTR：囊性纤维化跨膜转导调节因子

CFTR：囊性纤维化跨膜转导调节因子

CFTR：囊性纤维化跨膜转导调节因子

CFTR：囊性纤维化跨膜转导调节因子

3 讨 论

ABPA一般发生在具有特异性体质的人群，其免疫病理为特异性IgE介导的Ⅰ型变态反应和特异性IgG介导的Ⅲ型变态反应。据报道，在转诊中心和二级护理组中，ABPA的患病率分别为13%和0.7%～3.5%[18-19]；而在CF中，ABPA的患病率约为9%[20]。ABPA患者一般均伴有肺功能下降，且与临床常见的其他呼吸系统疾病较为类似，特别是与哮喘或浸润性肺结核容易混淆，其从首次发病到明确诊断往往需要很多年。本研究中，大多数患者表现为哮喘和支气管扩张等症状，对临床诊断容易引起误导，这与王梦雨等[1]对26例ABPA患者的临床表现特点分析结果一致，即认为ABPA在我国较少见且临床表现缺乏特异性，易误诊为哮喘。因此，加强对该疾病的认识，并寻找有效手段早期识别ABPA具有重要意义。

CFTR基因变异自1989年被发现与CF有关以来被西方国家广泛研究[21]，截至目前2 000余种变异被发现，其中CF患者是CFTR基因突变的主要检出人群[22]。ABPA患者表现的肺部症状与CF的肺部症状相似，且CF患者合并ABPA提示ABPA患者中可能存在CF基因的变异。针对高加索人的研究也证实了这种可能性，且在无CF合并症的ABPA患者中，CFTR基因的杂合变异较常见[2]。

目前，关于我国ABPA患者中CFTR基因变异的研究较少。Miller等[23]对11例ABPA患者和53例慢性支气管炎患者的CFTR基因多态性进行了研究，所有纳入患者中除ABPA患者中有1例为非洲裔人外，其余均为高加索人。结果显示，在11例ABPA患者中有6例患者存在CFTR基因多态性，其中有1例患者合并有△F508和R347H变异，4例患者存在ΔF508变异，1例患者存在R117H变异，而在53例慢性支气管炎患者中并未发现CFTR基因变异，故认为CFTR基因变异在ABPA的发生和发展过程中起重要作用，且ΔF508变异是ABPA患者CFTR基因多态性的主要类型。与上述研究类似，Marchand等[24]将21例ABPA患者作为观察组，43例支气管哮喘和142例健康受试者作为对照组，对两组受试者的CFTR基因变异情况进行研究。结果显示，观察组有6例(28.6%)存在CFTR基因变异，而对照组仅有8例(4.3%)存在CFTR基因变异，其中支气管哮喘患者中2例，健康受试者中6例。为进一步阐明CFTR基因多态性在ABPA发病过程中的作用，Agarwal等[16]对CFTR基因变异与ABPA的关系进行了荟萃分析，结果发现与对照组的非ABPA患者相比，ABPA患者CFTR基因变异的风险增加10.39倍，表明ABPA的发生可能与CFTR基因变异有关，但该研究仅纳入4篇文献，样本量有限可能会导致结果出现偏倚。

本研究结果显示，9例患者均存在CFTR基因变异。Marchand等[24]对21例ABPA患者CFTR基因变异研究发现，有6例存在CFTR基因变异，包括13种CFTR基因变异类型。Lebecque等[25]在18例ABPA患者中发现，有12例患者存在CFTR基因变异。本研究中，9例患者CFTR基因变异类型主要有4种，其中1、2、4、5、8、9号患者均发现位于11号外显子区域的c.1408G>A变异，1、2、5、8号患者均发现有c.2562T>G变异。所有ABPA患者均未检测到常见于高加索人的CFTR基因变异类型(F508del、G542X、G511D)。因此，ABPA的发病可能与CFTR基因变异有关。

有研究证实，在慢性哮喘和慢性鼻窦炎患者中也存在比较高的CFTR基因变异频率[26-27]。有学者认为，CFTR基因变异是导致呼吸系统疾病的一种重要致病因素[28]；但有研究认为，CFTR基因的杂合变异是机体对抗哮喘的一种保护机制[29-30]。而在ABPA中，其发病机制可能与多种固有免疫和适应性免疫相关的基因变异有关。有研究认为，CFTR基因多态性对ABPA的形成作用有限，可能由于某一个等位基因变异导致的黏膜病变使机体屏障功能受损，正常的免疫应答不能正常进行，进而激发机体免疫系统对曲霉菌产生过激免疫应答[31]，且患者携带的CFTR基因变异类型增多，并不会引起CFTR功能发生较大改变[32]。除CFTR基因多态性外，人类白细胞抗原(DL2、DR5)、表面活性蛋白A、甘露糖结合凝集素、Toll样受体、转化生长因子-β、白细胞介素-10、白细胞介素-4Rα基因变异引起的ABPA亦有报道[33-35]。

ABPA已被大量试验证实与很多种固有免疫和适应性免疫相关的基因变异有关，且CFTR基因变异与ABPA发病具有较强的相关性，我国ABPA患者CFTR基因变异类型可能与国外常见变异类型存在差异。今后需要不断完善我国基因样本库，建立一套适用中国人的CFTR基因变异库，以对疑似ABPA患者进行基因筛查，为临床医师做出正确诊断提供辅助信息。