固相萃取-高效液相色谱法测定结合雌激素乳膏中主要成分含量

杨 婷，李欣荣，姚 军，高晓黎

(新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

结合雌激素(conjugated estrogens，CE)是从孕马尿中提取的天然混合类雌激素[1-2]。结合雌激素类药物最早由美国惠氏-艾尔斯特制药公司生产，于1942年由FDA批准使用，商品名为PREMARIN(倍美力)，主要成分为雌酮硫酸钠(sodium estrone sulfate，Es)和马烯雌酮硫酸钠(sodium equilin sulfate，Eqs)[3-6]，临床用于治疗女性更年期综合症、骨质疏松症、与绝经相关的中-重度血管舒缩症、与雌激素缺乏相关的各种疾病等。

目前，结合雌激素类药物主要有两种剂型，分别是片剂和乳膏。其有效成分结合雌激素的含量测定一般采用HPLC法[7]和GC法[8]。相比于片剂，乳膏中结合雌激素含量(0.625 mg·g-1)较低，处方组成复杂，其中的白蜂蜡、单硬脂酸甘油酯等油相基质使乳膏破乳困难，使得检测时色谱柱柱效降低，影响2种主要成分的含量测定结果，导致结合雌激素回收率较低。因此，作者采用固相萃取-高效液相色谱法(SPE-HPLC)测定结合雌激素乳膏中2种主要成分含量，并进行方法学考察[9]，旨在建立更加科学、有效的结合雌激素测定方法。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

Es对照储备液(浓度441.0 μg·mL-1，批号20190623)、Eqs对照储备液(浓度288.6 μg·mL-1，批号20160404)、结合雌激素原料药(批号20190501)、结合雌激素乳膏(批号20190903)，新疆新姿源生物制药有限责任公司；空白基质(批号20190329)，自制。

磷酸二氢钾(批号20190516)，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈，色谱级，Sigma公司。

HY-5型回旋振荡器，金坛医疗仪器厂；KQ5200DE型超声仪，昆山超声仪器有限公司； LC-20AB-4型高效液相色谱仪，日本岛津公司；BT100-1L-A型蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司；Mulyifuge X3R型高速离心机，德国Thermo公司；SPE小柱(Sep-Pak®Vac 3cc C18 cartridges)，美国Waters公司。

1.2 对照溶液的制备

精密吸取Es对照储备液(441.0 μg·mL-1)2.5 mL置于5 mL容量瓶中，得到220.5 μg·mL-1Es对照溶液。

精密吸取Eqs对照储备液(288.6 μg·mL-1)2.5 mL置于5 mL容量瓶中，得到144.3 μg·mL-1Eqs对照溶液。

1.3 供试溶液的制备

精密称取1 g乳膏置于50 mL离心管中；加入25 mL纯化水，涡旋1 min，分散乳膏；再加入15 mL纯化水，超声20 min；室温振摇2 h后于4 ℃、13 000 r·min-1离心60 min；将上清液置于另一离心管中。

用3 mL甲醇活化SPE小柱，再用3 mL 5%甲醇水溶液润洗SPE小柱。

精密吸取20 mL下清液过SPE小柱，用2 mL 5%甲醇水溶液润洗SPE小柱，甲醇溶液洗脱，收集洗脱液3 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进样测定。

色谱条件：Agilent C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.025 moL·L-1KH2PO4(1∶3，体积比)，流速1.0 mL·min-1，检测波长205 nm，进样量20 μL，柱温35 ℃，运行时间30 min。

1.4 原料药溶液的制备

精密称取1.166 g结合雌激素原料药至容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.625 mg·mL-1原料药溶液。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的确定

结合雌激素乳膏成分复杂，在含量测定前需进行前处理。分别采用有机溶剂萃取法、液-液萃取法和固相萃取法对乳膏进行前处理，结果发现：有机溶剂萃取法需要加入乙醚多次萃取[8]，操作复杂，且主要成分有损失；液-液萃取法需加入饱和BaCl2溶液，萃取率低，且除杂效果不佳；而固相萃取法中使用SPE小柱，可以消除溶液中赋型剂及油相基质的干扰，除杂效果好，且可以对目标成分进行富集，使目标成分纯度更高，在检测时对色谱柱的损害小，并且可以提高样品前处理效率。因此，采用固相萃取法对乳膏进行前处理。

2.2 标准曲线

精密吸取对照溶液(Es 220.5 μg·mL-1、Eqs 144.3 μg·mL-1)2.5 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇-水(1∶1)定容至刻度，采用倍量稀释法进行稀释，得到浓度(μg·mL-1)分别为110.25、55.125、27.57、13.78、6.89的Es系列溶液，浓度(μg·mL-1)分别为72.15、36.075、18.0375、9.02、4.5的Eqs系列溶液；将各系列溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进样测定。以色谱峰面积(y)为纵坐标、溶液浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明：Es在6.89～220.5 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y=81307x-45891，R2=0.9996；Eqs在4.5～144.3 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y=72874x-65248，R2=0.9999。

2.3 高效液相色谱图

精密吸取混合对照溶液(Es 220.5 μg·mL-1、Eqs 144.3 μg·mL-1)2.5 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇-水(1∶1)定容至刻度，经0.22 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进样测定，其高效液相色谱图如图1所示。

图1 混合对照溶液的高效液相色谱图Fig.1 HPLC of mixed reference solution

2.4 精密度实验

分别精密吸取Es和Eqs对照溶液20 μL，按色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD分别为0.15%和0.19%。表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验

称取结合雌激素乳膏1 g共6份，按1.3方法制备供试溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进样测定，其高效液相色谱图如图2所示。

图2 供试溶液的高效液相色谱图Fig.2 HPLC of test solution

由图2可得到结合雌激素含量分别为74.793%、75.963%、73.887%、75.040%、76.581%、75.213%，RSD为1.25%。表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性实验

称取结合雌激素乳膏1 g，按1.3方法制备供试溶液，在4 ℃下分别放置0 h、24 h、48 h，经0.22 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进样测定，测得结合雌激素含量分别为75.239%、76.312%、76.563%，RSD为0.925%。表明供试溶液在48 h内稳定。

2.7 加标回收率实验

称取空白乳膏基质9份分别置于50 mL离心管中，3份为一组，按1.4方法配制0.625 mg·mL-1的原料药溶液。分别吸取0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL的原料药溶液置于50 mL离心管中，配制成标示量的80%、100%和120%，按1.3方法制备供试溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进样测定，计算加标回收率，结果见表1。

表1加标回收率(n=3)

Tab.1 Adding standard recovery rate(n=3)

由表1可知，标示量80%、100%和120%的Es供试溶液的平均加标回收率分别为105.32%、103.10%、105.81%，RSD分别为0.60%、1.32%、1.57%；标示量80%、100%和120%的Eqs供试溶液的平均加标回收率分别为95.15%、96.81%、96.37%，RSD分别为0.88%、1.57%、1.09%。

3 结论

采用SPE-HPLC法同时测定结合雌激素乳膏中雌酮硫酸钠和马烯雌酮硫酸钠的含量。该方法准确度高，精密度和灵敏度均能满足测定要求，加标回收率满足低剂量药物的检测要求，适用于结合雌激素乳膏中主要成分含量测定。