黑枸杞花青素抑制曲奇饼干中丙烯酰胺效果的研究

刘健南，王小博

（佛山职业技术学院食品科学系，广东佛山528000）

丙烯酰胺（acrylamide）是一种白色晶体，易溶于水、乙醇、甲醇、丙酮等极性溶剂，作为生产聚丙烯酰胺和同聚体的中间体在工业上被广泛应用[1-2]。丙烯酰胺是中等毒性的亲神经毒物，很容易被生物体的消化道、皮肤、肌肉或其他途径吸收，引起急慢性中毒[3-4]，同时其具有生殖毒性[5]、致畸性和致癌性[6-7]。研究表明，一些油炸、焙烤的淀粉类食品中存在丙烯酰胺被检出，因此，抑制食品丙烯酰胺的产生越来越受到重视。Oral 等[8]研究了7 种多酚和植物提取物对丙烯酰胺的抑制作用，结果发现表儿茶素在化学模拟体系中对丙烯酰胺的抑制效果较好，抑制率可达74%。Zeng 等[9]发现在食品体系中添加VB能有效降低丙烯酰胺的生产。因此，天然抗氧化剂对食品体系中丙烯酰胺的抑制作用已成为研究的热点。花青素，又称作花色素，是一类水溶性的类黄酮化合物[10-11]，具有很强的抗氧化和抗自由基等功能[12-13]，食品添加剂联合专家委员会建议每日允许摄入剂量值为0～2.5 mg/kg，其在食品加工中应用广泛，但是花青素用来抑制丙烯酰胺的形成鲜有报道。本文以黑枸杞花青素为研究对象，探讨对曲奇饼干中丙烯酰胺形成的抑制作用，进而确定合适的添加剂量，为食品加工中抑制丙烯酰胺的生成提供试验依据，期望为后续开发一种高效抑制丙烯酰胺的食品添加剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丙烯酰胺标准品（纯度＞99%）：美国Sigma 公司；小麦粉、黄油、糖霜、饮用水、食用盐：本地超市；黑枸杞花青素：佛山职业技术学院食品科学系食品加工实验室制备；岛津LC-20AT 高效液相色谱仪：日本岛津公司；FA1104A 电子天平：上海精天电子仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 曲奇饼干的制备

曲奇的制作方法参考杨转红等[14]，每组曲奇独立焙烤2 次，并做空白。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 焙烤温度的选择

焙烤时间为12 min，花青素添加量为0.3 g/kg 的条件下，在焙烤温度为 160、170、180、190、200 ℃时，测定并计算丙烯酰胺抑制率，并做空白试验。

1.2.2.2 焙烤时间的选择。

固定焙烤温度为180 ℃，花青素添加量为0.3 g/kg，焙烤时间分别为 8、10、12、14、16 min 时，测定并计算丙烯酰胺抑制率，并做空白试验。

1.2.2.3 花青素添加量选择

固定焙烤温度为180 ℃，焙烤时间为12 min 的条件下，花青素添加量为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg 时，测定并计算丙烯酰胺抑制率，并做空白试验。

1.2.3 响应面优化

在单因素试验结果基础上，采用Design-Expert 8.06 软件的Box-Behnken 设计原则设计试验，并对焙烤条件进行优化。以焙烤温度、焙烤时间、花青素添加量3 个因素作为试验因素，检测并计算丙烯酰胺的抑制率。选取一组曲奇饼干添加等量的原花青素做阳性对照。响应面试验因素和水平表见表1。

表1 响应面试验因素和水平Table 1 Response interview test factors and levels

1.2.4 样品处理与检测

取适量曲奇饼干粉碎，称取1.00 g 曲奇粉末于50 mL 离心管中，加入10.00 mL 1 g/L 的蚁酸溶液溶解，超声振荡 15 min，涡旋 10 min，离心（4 ℃，12 000 r/min，20 min）。吸取离心管中部的水溶液2.00 mL，过0.22 μm的滤膜，高效液相色谱检测丙烯酰胺含量。检测条件：色谱柱：Hypersi10DS2-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；进样量：10 μL；流速：1 mL/min；流动相，乙腈 ∶甲醇 ∶水=2 ∶5 ∶93（体积比）；柱温为 40 ℃；流速：0.6 mL/min；分析时间：15 min。计算丙酰酰胺抑制率：

丙烯酰胺抑制率/%=[（AM0-AM）/AM0]×100

式中：AM0为空白对照组丙烯酰胺含量，μg/g；AM为试验组丙烯酰胺含量，μg/g。

1.3 统计分析

采用SPSS19.0 软件对试验数据进行统计分析，采用Origin 8.5 软件绘图，采用Design-Expert.V8.0.6 进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 焙烤温度对丙烯酰胺抑制率的影响

焙烤温度对丙烯酰胺抑制率的影响见图1。

图1 丙烯酰胺抑制率与焙烤温度的关系Fig.1 Relationship between acrylamide-inhibition rate and baking temperature

由图1 可知，随着温度升丙烯酰胺抑制率呈现先升高后下降的趋势。通过组内比较，在170 ℃时，丙烯酰胺的抑制率显著升高（P＜0.05），当温度为 180 ℃，丙烯酰胺抑制率变化极其显著（P＜0.01）。因此，初步确定180 ℃为最佳的焙烤温度。丙烯酰胺是美拉德反应的中间产物，而非终产物。在美拉德反应中，丙烯酰胺的形成和消减是同时存在的，高温更益于丙烯酰胺的消减。在焙烤初期，丙烯酰胺的形成大于消减，丙烯酰胺含量不断上升，随着焙烤的进行，丙烯酰胺形成所需的反应物减少，消减反应逐渐超过形成反应，丙烯酰胺含量呈现下降趋势[15]。同时随着温度升高花青素降解也会加快，近一部导致丙烯酰胺抑制率降低。

2.1.2 焙烤时间对丙烯酰胺抑制率的影响

焙烤时间对丙烯酰胺抑制率的影响见图2。

图2 丙烯酰胺抑制率与焙烤时间的关系Fig.2 Relationship between acrylamide-inhibition rate and baking time

由图2 可知，随着焙烤时间的增加，丙烯酰胺抑制率也逐渐增加。通过组内比较，当焙烤时间为10、12 min 时，丙烯酰胺抑制率显著升高（P＜0.05）；当焙烤时间为14 min 时，丙烯酰胺抑制率升高极其显著（P＜0.01）。但是随着焙烤时间进一步延长，丙烯酰胺抑制率又呈下降趋势。黑枸杞花青素作为一种天然抗氧化物，在长时间高温加热条件下本身的性质会发生变化，使其抑制作用发生改变[16]。因此，初步确定14 min为最佳的焙烤时间。

2.1.3 花青素添加量对丙烯酰胺抑制率的影响

花青素添加量对丙烯酰胺抑制率的影响见图3。

图3 丙烯酰胺抑制率与花青素添加量的关系Fig.3 Relationship between acrylamide-inhibition rate and the amount of anthocyanin added

如图3 可知，花青素添加量与丙烯酰胺的抑制率均呈非线性变。当花青素添加量为0.2 g/kg 时，丙烯酰胺抑制率增加极其显著（P＜0.01），此时达到最大。研究表明，丙烯酰胺生成量与抗氧性有密切关系，抗氧化性强，有利于花青素抑制丙烯酰胺产生[17]。同时抗氧化剂并不能有效破坏或抑制丙烯酰胺的合成，有的甚至还能促进丙烯酰胺的合成作用；但它们的氧化产物可以通过直接破坏丙烯酰胺或其合成的前体物质天冬酰胺而起到抑制作用[10]。花青素作为一种抗氧化剂，其也符合抗氧化悖论，即浓度增大到一定程度时，抗氧化能力反而减小，因此对丙烯酰胺的抑制作用也随之减弱[18]。因而，初步确定花青素最佳添加量为0.2 g/kg。

2.2 响应面分析

由单因素试验结果可以看出，黑枸杞花青素对曲奇饼干中花青素的抑制效果取决于焙烤温度、焙烤时间、花青素添加量的选择以及各提取条件间的相互组合[19]。采用响应面法优化抑制曲奇饼干丙烯酰胺的最佳条件，在单因素试验的基础上，以焙烤温度、焙烤时间、花青素添加量为自变量，丙烯酰胺抑制率为响应值，采用Design Expert 8.06 软件根据Box-Behnken 设计原则设计试验，并对所得数据进行分析。

2.2.1 拟合模型

根据Box-Behnken 设计原则，Design Expert 8.06软件设计了17 组试验，被用于优化抑制丙烯酰胺生成的条件，试验结果见表2。

表2 响应面分析方案及结果Table 2 Response surface analysis scheme and results

续表2 响应面分析方案及结果Continue table 2 Response surface analysis scheme and results

采用方差分析（ANOVA），二阶多项式模型来计算预测的响应，公式如下：

Y=68.41+6.82A+2.54B+3.91C-2.74AB+0.27AC+2.14BC-10.21A2-14.79B2-9.49C2，其中，R2=0.990，表明方程可信度较好，能够准确地分析和预测抑制丙烯酰胺生成的条件。

采用F 检验、P 值来评价模型方程的统计学意义，F 值和P 值用来检验每个系数的显著性。F 越大，P 值越小，则相应的系数越显著。丙烯酰胺抑制率模型方差分析结果见表3。

表3 丙烯酰胺抑制率模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance of model for inhibition rate of acrylamide

根据方差分析结果，模型的 F 为 77.35，P＜0.000 1，这表明模型极显著。系数 A、B、C、AB、A2、B2、C2均显著（P＜0.05），AC、BC 系数并不显著（P＞0.05）。决定系数（R2=0.990）的值接近于1，表明预测值与实际值具有有效的关联性。调整后的决定系数（R2adj=0.977 2）也接近1，这表明试验值可以由模型来预测。

2.2.2 响应面分析

响应面模型是表达不同参数对丙烯酰胺抑制效果的最好方式。三维（3D）响应面作为回归方程的一个重要组成部分，可以描述两个变量之间的相互作用，并确定它们的最优水平[13]。它提供了一个有效的方法来反映响应值与各变量试验水平间的关系及两个变量间相互作用的类型[20]。图的形状可以反应变量之间的相互作用是否显著[13]。图4 显示焙烤温度、时间、花青素添加量之间的相互作用对丙烯酰胺抑制率的影响。

图4 不同因素对丙烯酰胺抑制率的影响Fig.4 The influence of different factors on the inhibition rate of acrylamide

结合方差分析，可以知道焙烤温度－时间之间的相互作用丙烯酰胺抑制率影响显著（图4A）；花青素添加量－焙烤温度之间的相互作用丙烯酰胺抑制率影响显著（图4B）；花青素添加量－焙烤时间之间的相互作用丙烯酰胺抑制率影响显著（图4C）。由此可知，各因素之间存在明显的交互作用。采用花青素抑制曲奇中丙烯酰胺时，温度不宜过高，时间不宜过长。

回归分析结果与3 个因素对响应值的影响以及各因素之间的交互影响相吻合。在响应面最高点和等高线所选范围内存在极值，即为最优点。综上分析，丙烯酰胺抑制率最高时（69.46%），焙烤温度为184.76 ℃，焙烤时间为12.32 min，花青素添加量为0.32 g/kg。根据实际试验条件，调整条件为焙烤温度为185 ℃，焙烤时间为12 min，花青素添加量为0.32 g/kg。在此条件下，重复5 次，丙烯酰胺抑制率为69.34%，接近预测值69.46%，证明拟合响应面模型的适用性。研究表明原花青素可以有效的抑制食品中丙烯酰胺的产生[21]，在此条件下加入等量的原花青素，饼干中丙烯酰胺抑制率为69.34%。因此，响应面设计更好地预测了曲奇中丙烯酰胺抑制效果，可信度高。表明花青素能够有效抑制曲奇中丙烯酰胺的产生。

3 结论

研究表明，黑枸杞花青素可以有效抑制丙烯酰胺的产生。方差分析结果表明，曲奇中丙烯酰胺抑制效果受焙烤时间、温度，以及花青素添加量影响较大。通过响应优化及根据实际试验条件，抑制丙烯酰胺产生最佳条件为焙烤温度为185 ℃，焙烤时间为12 min，花青素添加量为0.32 g/kg，在此条件下丙烯酰胺抑制率可达到69.34%。