中国汉族人泛醌NADH脱氢酶Fe-S蛋白1基因多态性与氯氮平所致代谢综合征的关联研究

陈艳，方新宇，汪也微，余玲芳，王丹丹，张毅，蔡军，宋立升，张晨

第二代抗精神病药(SGAs)以其良好的疗效和较少的锥体外系反应成为治疗精神分裂症的主要治疗手段[1]。然而，大量证据[2-4]表明SGAs的使用可显著增加患者罹患代谢综合征(MS)的可能性。既往的家系研究[5]发现，抗精神病药所致MS(AIMS)的遗传度为60%～80%，遗传因素在AIMS发生中起关键作用。氯氮平不仅是其他SGAs的原型药，且更易造成MS[4,6]；故针对氯氮平相关MS的遗传学研究可能更有利于研究AIMS机制。

线粒体作为细胞能量代谢的中枢，在有氧代谢中的作用无可或缺[7]。线粒体功能失调与冠状动脉硬化、糖尿病、肥胖等多种代谢相关疾病关联[8-10]。 电子传递链又名氧化呼吸链，包含4种具有氧化还原功能的复合体，其与ATP合酶以及两个游离的电子载体——泛素和细胞色素c共同组成氧化磷酸化系统(OXPHOS)，在线粒体能量产生中起关键作用[11-12]。复合体I即NADH泛素氧化还原酶，作为氧化呼吸链中最大、最复杂的组成部分，具有45个亚基[13-14]，其中人泛醌NADH脱氢酶Fe-S蛋白(NDUFS1)由核基因NDUFS1编码，为复合体I最大的亚基，且在其功能中起关键作用[15]。经上海市精神卫生中心伦理委员会批准，本研究以NDUFS1多态性为切入点，通过病例-对照研究探索线粒体复合体I相关核基因在AIMS中的可能作用。

1 对象和方法

1.1 对象

入组者为上海市精神卫生中心闵行分院住院的汉族精神分裂症患者388例；入组者均符合《美国精神障碍诊断与统计手册》第4版(DSM-Ⅳ)诊断标准；病程≥5年且病情处于稳定期>6个月；年龄18～60岁；单药服用氯氮平≥24个月或合并使用第一代抗精神病药；排除其他精神障碍。入组者或其监护人均签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料的采集及分组方法 收集入组患者一般临床资料，包括性别、年龄、病程、服药剂量、服药时间等；测量腰围、血压、身高、体质量，计算体质量指数(BMI)。入组次日清晨抽取空腹静脉血检测空腹血糖(FBG) 、三酰甘油(TG) 、高密度脂蛋白 (HDL)水平(由日立7170 型全自动生化仪完成)。根据美国国家胆固醇教育项目成人治疗组第3次报告(NCEP-ATP III)中MS诊断标准[16]，符合下列≥3项为患有MS:①腹部肥胖：腰围≥90 cm(中国男性)或≥80 cm(中国女性); ②TG≥1.70 mmol/L; ③HDL<1.00 mmol/L (男) 或<1.30 mmol/L (女) ;④血压异常:收缩压(SBP)/舒张压(DBP)≥130/85 mmHg，或此前已诊断为高血压; ⑤FPG≥5.6 mmol/L，或已接受降糖治疗。

1.2.2 NDUFS1多态性检测 ①位点选择：根据HapMap数据库中国北京汉族人群数据进行标签单核苷酸多态性(SNP)选择。设参数：决定系数(r2)>0.8，最小等位基因频率(MAF)>0.10，经检索在NDUFS1中筛选出4个位点(rs13024804、rs1044120、rs6435330、rs4147713)；②DNA提取和基因型的检测：抽取入组者外周静脉血2 ml，保存于EDTA抗凝管，其中1 ml用于提取DNA，另外1 ml于-20 ℃冷冻保存备用。其中提取DNA过程通过使用天根生化科技(北京)有限公司的离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒完成。应用SNaPshot 单核苷酸多态性(SNP)分型技术[17-18]对筛选出的4个位点进行分型；主要步骤包括应用引物设计软件premier 3.0进行SNP位点的上、下游引物的设计；使用9600型聚合酶链式反应(PCR)仪(美国应用生物系统公司，ABI)进行4个位点扩增；根据SNaPshot SNP分型技术进行SNP分型。

1.2.3 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件包及SHEsis 遗传分析软件；两组计量资料比较用t检验或方差分析；计数资料比较使用χ2检验；不同基因型对代谢指标的影响，则通过协方差分析；检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 一般资料分析

388例入组者中，符合MS诊断者159例(MS组)，非MS组229例。两组性别、年龄、病程、服用氯氮平时间、剂量及血药浓度比较差异无统计学意义；MS组BMI、腰围、FBG、TG、SBP、DBP 明显高于非MS组，HDL明显低于非MS组。见表1。

表1 两组一般临床资料比较

2.2 两组间SNP各位点等位基因及基因型分布的比较

两组SNP各位点的等位基因及基因型分布差异无统计学意义。见表2。

表2 两组SNP 4个位点基因型及等位基因的频率分布比较(例数)

2.3 不同性别及遗传模式下两组SNP中4个位点等位基因与基因型分布比较

两组女性患者中，rs1044120、rs6435330、rs4147713位点等位基因与基因型分布差异有统计学意义，且经Bonferroni 校正后差异仍存在。此外，显性遗传模式下，rs1044120(GT+TT vs GG,P=0.002,OR=0.25,95%CI：0.10～0.61)、rs6435330(GT+TT vs GG,P<0.001,OR=0.21,95%CI：0.09～0.50)、rs4147713(TG+GG vs TTP=0.002,OR=0.26,95%CI：0.11～0.61)组间基因型分布差异有统计学意义，经Bonferroni 校正后差异仍存在；而隐形遗传模式下此3个位点基因型分布则差异无统计学意义。

2.4 性别分层下各代谢指标在不同个体与GG基因型个体之间的差异

协方差结果显示，NECP-ATP III中判断是否具有MS的各代谢相关指标(BMI、腰围、GLU、TG、HDL、SBP以及DBP)中，男性rs1044120位点T等位基因携带者血浆HDL水平显著高于非携带者[(1.33±1.26) mmol/L vs (1.09±0.48)mmol/L,P=0.034]，而女性患者群体中未见此显著差异[(1.80±1.24) mmol/L vs (1.89±1.72) mmol/L,P=0.787]；女性患者中rs6435330位点T等位基因携带者DBP显著低于非携带者[(71.43±7.134)mmHg vs (74.47±6.419) mmHg,P=0.032]；而男性患者群体中未见此显著差异[(73.13±7.142) mmol/L vs (74.76±6.81) mmol/L,P=0.056]。

3 讨论

线粒体在糖脂代谢等过程中起至关重要作用。抗精神病药物的使用可致线粒体线功能异常；该过程可能参与AIMS的机制，而NDUFS1编码的NDUFS1蛋白为复合体I亲水臂的一部分，负责电子的转移，是线粒体复合体I的关键亚基[15]。该基因突变可导致复合物I缺陷，并进一步造成线粒体内活性氧(ROS)增加[19]。研究[20-21]发现ROS在下丘脑弓状核中食欲相关神经元的激活中起重要作用，故ROS水平对下丘脑能量稳态的维持产生影响。最近研究[22]也发现慢性精神分裂症患者中氧化应激水平升高，且其相关指标如血浆丙二醛(MDA)水平与患者BMI存在正相关。因此有理由推测NDUFS1的突变可能通过影响氧化应激水平而参与AIMS的机制。

本研究结果显示，显性遗传模式下，rs1044120、rs6435330、rs4147713这3个位点的突变可显著降低女性而非男性精神分裂症患者服用氯氮平致MS风险。因性激素的影响，MS等相关代谢疾病的发生以及特点具有性别差异。相较于男性，女性的脂肪组织的合成以及存储效率更高，男性与女性间不同的生活习惯以及压力感受也可对代谢水平产生影响[23]；因此性别是AIMS的临床异质性因素之一。

协方差分析显示，携带rs6435330位点T等位基因的女性患者DBP显著较低；携带rs1044120位点T等位基因的男性患者HDL水平更高，HDL为MS的保护因素，其体内水平的升高可降低罹患MS风险。相关报道[24]显示，不同性别间HDL水平的差别更多的是来源于性染色体而非性激素，故携带更多X染色体的女性中HDL水平更高；其具体机制可能还需要基础研究的进一步探索。

有研究[17]认为NDUFS1多态性与抗精神病药所致体质量增加(AIWG)显著相关，其中rs6435326位点AA基因型的个体平均体质量变化显著高于AT和TT基因型个体；部分抗精神病药临床试验(CATIE)则显示NDUFS1基因rs1801318 与AIWG有关。AIWG是AIMS的一个重要方面，虽该研究与本研究选择了相同基因的不同位点作为标签SNP，但最终结果均指向阳性，进一步说明NDUFS1在抗精神病药导致的代谢障碍中的重要作用。

此外，rs1044120位点位于NDUFS1的3'端非编码区(3'-UTR)，rs6435330和rs4147713位于内含子区域，其突变均不直接影响转录结果。然而现研究指出外显子区域的突变并不能完全解释遗传疾病的发生，非外显子区域突变位点的重要作用在人们的重视下逐渐显现出来。虽3'-UTR对基因表达作用的具体机制并未完全阐明，但有证据显示3'-UTR的突变位点可能对转录后调控产生影响[25]。此外，内含子通过增加转录率、核输出和转录稳定性来提高转录水平，并且还可以提高mRNA的翻译效率[26]。而内含子突变可能影响转录调控元件和非编码RNA基因从而影响基因表达，且目前研究已发现大量内含子区域突变与多种疾病相关[27]。这可能是这3个SNP的突变能够引起表型改变的重要机制之一。

本研究具有一定局限性。首先，本研究结果中具有显著的性别差异，吸烟群体中以男性居多，而吸烟与体内氧化应激水平相关，但遗憾的是本研究在收集受试者数据时并未收集受试者的吸烟情况，故不能排除吸烟对结果的影响。其次，因长期服用氯氮平的住院患者中性别分布不均匀；本研究女性患者明显少于男性，性别分层后结果并不稳固；故有必要在扩大样本量的基础上开展更为深入的研究。