色谱树脂法分离纯化两性霉素B方法研究

郭月玲，王崔岩，李 敏，仲伟潭*，赵 辉，张雪霞

(1．微生物药物国家工程研究中心，河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄 050015；2．华北制药集团华胜有限公司,河北 石家庄 052160)

两性霉素B属于多烯大环内酯类抗真菌抗生素,其作用机制主要是通过与敏感真菌细胞膜上的固醇相结合,损伤细胞膜的通透性,导致细胞内重要物质如钾离子、核苷酸和氨基酸等外漏,破坏细胞的正常代谢从而抑制其生长。临床上适用于全身性的真菌感染治疗，特别对隐球菌、白色念珠菌等引起的脑膜炎、心内膜炎、败血症、肺部及尿路感染等具有良好疗效[1]。

工业生产上，两性霉素B粗品需经反复结晶洗涤方能得到合格精品，溶剂消耗量大，成本高。如何在提高两性霉素B产品安全性的同时简化工艺，降低成本，获得更高纯度结晶粉，提高产品同行业竞争力，一直是技术人员着力解决的问题[2]。作者采用色谱树脂法对两性霉素B粗品进行色谱柱层析分离，层析液再结晶、干燥，得到了高纯度的两性霉素B精粉，对分离纯化工艺进行了优化，以期为规模化工业生产提供指导。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

两性霉素B粗品,华北制药集团新药研究开发有限公司；两性霉素B标准品,华北制药集团华胜公司。

乙腈，色谱纯，霍尼韦尔公司；二甲基甲酰胺(DMF)，分析纯，天津百世化工有限公司；丙酮，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；工业乙醇，沧州兴隆化工有限公司；其它试剂均为国产分析纯；去离子水，自制。

色谱三号、色谱五号、色谱七号树脂，上海华震公司。

中压层析系统(C-635检测器，C-615控制器，C-601泵，C-616收集器)，瑞士Buchi公司； LC-2010A型高效液相色谱仪，岛津；磁力搅拌器。

1.2 方法

1.2.1 有关物质HPLC检测条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：流动相A为乙腈-磷酸(300∶700)溶液(pH值1.0±0.05)，流动相B为乙腈-磷酸(500∶500)溶液(pH 1.0±0.05)，按表1进行线性梯度洗脱；流速0.8 mL·min-1；柱温25 ℃，检测波长：303 nm和383 nm；进样量：100 μL[3]。

表1 流动相A、B不同时间配比

Tab.1 The proportion of mobile phase A and B at different time

时间/min流动相A/%流动相B/%01000502080511000601000

1.2.2 树脂型号的筛选

取色谱三号、色谱五号、色谱七号树脂各100 g，分别用乙醇浸泡2～4 h，并不时搅动，使树脂充分溶胀。将已充分溶胀的树脂装柱，以2 BV·h-1流速、用5～8 BV的乙醇淋洗，直至流出液在试管中用水稀释不浑浊为止，再用去离子水洗涤至乙醇浓度小于1%。用DMF-75%乙醇(1∶4 )混合溶液(pH值3.5～4.5)平衡中压层析系统。取0.5 g两性霉素B粗品，加入DMF分散，再加入一定量的乙酸调节溶液pH值为3.5～4.5，溶解，加入珍珠岩助滤，过滤得清液，加入4 BV75%乙醇，得到两性霉素B粗品DMF-乙醇溶液。加样于层析柱上，动态过柱[4]，过柱速度5 mL·min-1，收集层析液，HPLC检测有关物质去除效果，以色谱树脂对两性霉素B的总杂质及最大单杂的去除效果和结晶收率进行筛选。

1.2.3 层析柱高径比的选择

取两性霉素B粗品DMF-乙醇溶液，加样于高径比分别为5、7、9、11的层析柱上，过柱速度5 mL·min-1，收集层析液，HPLC检测有关物质去除效果，以高径比对两性霉素B的总杂质及最大单杂的去除效果进行筛选。

1.2.4 上样量的选择

采用色谱三号树脂为填料，分别按照每100 g填料加载两性霉素B粗品1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g、3.0 g的上样量加样于层析柱上，过柱速度5 mL·min-1，收集层析液，HPLC检测有关物质去除效果，以上样量对两性霉素B的总杂质及最大单杂的去除效果进行筛选。

1.2.5 过柱速度的选择

取两性霉素B粗品DMF-乙醇溶液，加样于层析柱上，过柱速度分别为3 mL·min-1、5 mL·min-1、6 mL·min-1和7 mL·min-1，收集层析液，HPLC检测有关物质去除效果，以过柱速度对两性霉素B的总杂质及最大单杂的去除效果进行筛选。

1.2.6 结晶

取两性霉素B层析液，加入适量甘油，调溶液pH值5.3～5.6，搅拌2 h，结晶，抽滤，继而用乙醇、丙酮分别挖洗抽滤，40 ℃减压干燥得到两性霉素B精粉。HPLC检测精粉有关物质含量，计算结晶收率。

2 结果与讨论

2.1 树脂型号的确定(表2)

由表2可知，色谱三号树脂对杂质的去除效果[5]最好,层析液结晶后有关物质含量最低，结晶收率也较高，且结晶产品中单个有关物质最高含量不超过1.5%，远低于药典标准。因此，选择色谱三号树脂作为填料。

2.2 层析柱高径比的确定(图1)

表2 色谱树脂型号对去除杂质效果的影响/%

Tab.2 The effect of type of chromatographic resin on impurity removal/%

注：ω总为结晶产品中总的有关物质含量;ω单大为单个有关物质最高含量，下同。

图1 高径比对去除杂质效果的影响Fig.1 The effect of ratio of height to diameter on impurity removal

从图1可知，高径比越大，对杂质的去除效果越好。但是考虑到实际操作，并不是高径比越大越好，一般只要能达到分离效果就可以了。因为高径比越大，柱压就越高，对附属设备要求增加，如需要高压泵、耐压管路等。因此，选择层析柱高径比为7。

2.3 上样量的确定(表3)

表3 上样量对去除杂质效果的影响

Tab.3 The effect of sample amount on impurity removal

上样量/[g·(100 g填料)-1]溶液体积mL结晶产品中有关物质含量/%ω总ω单大1.002.41.21.5752.41.22.01002.51.32.51253.31.63.01504.22.3

从表3可知，随着上样量的增加，树脂对杂质的去除效果逐渐降低。综合考虑，在保证有关物质去除效果的前提下，选择上样量较大数值即1.5 g·(100 g填料)-1，无论总杂质还是单个杂质含量都最低。

2.4 过柱速度的确定(图2)

从图2可知，过柱速度越快，对杂质的去除效果越

图2 过柱速度对去除杂质效果的影响Fig.2 The effect of sample speed on impurity removal

差。这是因为，过柱速度过快，杂质尚未进入树脂颗粒内部被吸附，就已经流走。因此，过柱速度应适当减慢，有利于杂质吸附，但也并非越慢越好，过柱速度过慢会延长产品的生产周期，造成产品降解及不必要的人工及动力消耗，提高生产运营成本。综合考虑，选择过柱速度为5 mL·min-1。

2.5 结晶甘油加入量的确定(表4)

表4 甘油加入量对去除杂质效果的影响

Tab.4 The effect of additive amount of glycerol on impurity removal

甘油加入量‰过滤时间min结晶收率%结晶产品中有关物质含量/%ω总ω单大04089.12.51.30.33890.42.01.00.63591.81.70.81.03092.21.40.61.52992.31.40.62.02992.21.40.6

在结晶过程中，加入一定比例甘油，可以有效控制结晶速率，增大占有较大比例的有效物质的结合概率，从而有效避开相关杂质，进而结合而形成结晶，造成可结晶杂质浓度过低留在母液中，从而达到杂质的有效去除。由表4可知，随着甘油加入量的增加，结晶产品中杂质含量越来越低，但达到一定程度后不再降低。因此，选择甘油加入量为1.0‰，所得两性霉素B纯度大于98.5%，总收率大于77%。两性霉素B精粉HPLC图谱见图3。

3 结论

采用色谱三号树脂为填料，加载两性霉素B粗品DMF-乙醇溶液于层析柱上，层析柱高径比为7，过柱速度为5 mL·min-1，上样量为1.5 g·(100 g填料)-1，

图3 两性霉素B精粉的HPLC图谱Fig.3 HPLC spectrum of Amphotericin B refined powder

所得层析液加入1.0‰甘油，并调溶液pH值5.3～5.6，结晶，过滤，乙醇、丙酮分别挖洗抽滤，干燥得到纯度大于98.5%的两性霉素B精粉，总收率大于77%。该分离纯化工艺稳定，流程简单，提高了产品收率，质量稳定可控，适于工业化生产。