太子参多糖治疗大鼠糖尿病足溃疡研究

王林莉 庞文生 胡 娟,2*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003

糖尿病足(diabetic foot) 是糖尿病慢性致残性并发症，又叫糖尿病肢端坏疽；即糖尿病患者合并各种不同程度末梢血管病变和神经病变导致下肢感染、溃疡和/或深部组织破坏[1]。目前全球糖尿病患者高达4.25亿，而中国糖尿病人数最多，达1.14亿，此外还有3.5亿多糖尿病高危人群[2]。糖尿病足部溃疡，是糖尿病常见严重并发症，糖尿病患者患有血管病变、神经病变等并发症，如周围神经炎、周围血管病变和胶原异常，导致皮肤创伤难治性，往往发展为慢性难愈性溃疡。此即糖尿病患者残疾，非创伤性下肢截肢的主要原因[3]。

我国古籍中对糖尿病足的记载始见于《黄帝内经》的《灵枢·痈疽篇》，书中写到：“发于足趾，名脱痈。其状赤黑，死不治；不赤黑，不死，治之。不衰，急斩之，不则死矣”。宋代窦汉卿《窦氏外科全书·卷二·附甲背发说》曰：“甲背发，此症由消渴之症发于手足指，名曰脱疽，其状赤紫者死，不赤者可治”。清代高秉钧所著《疡科心得集》云：脱疽者，足指生疔，重者溃而紫黑，不疼不痒，久则脱去其节，故名之。亦有患于手指者，名曰蛀节疔，重者腐去本节，轻者痉挛。历代古籍中对糖尿病足的称谓有所变化，有脱痈、脱疽等；但都描述出了糖尿病足的病状及其难愈、致残致死的特征。

研究表明[4-8]，黄芪多糖、灵芝多糖、白及多糖及天然多糖水凝胶等能促进糖尿病足溃疡的愈合，促进溃疡部位成纤维细胞的增殖以及胶原合成。太子参多糖是太子参中具有多种生物活性的一类物大分子物质。国内外多名学者的研究表明，太子参多糖具有降血糖、改善糖耐量、促进胰岛素分泌、保湿、抗衰老、皮肤组织修复等作用，同时可提供湿性愈合环境加速创面愈合[9-11]。因此，研究以大鼠糖尿病足溃疡创面愈合率为指标，探讨太子参多糖治疗大鼠糖尿病足溃疡的药效，以期为中药太子参进一步开发和利用提供新的思路。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 健康Wistar雄性大鼠32只，体重180±20 g，清洁级，实验动物饲养于福建省中医药研究院动物中心。大鼠采用单笼喂养，喂养温度：25 ℃左右，湿度60%左右。大鼠喂食实验动物配合饲料，自由摄食及饮水。

1.2 仪器 中药材提取罐设备(武汉中大制药设备有限公司)；药材粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；MOKULYOD-230型冷冻干燥仪(Thermo Fisher公司)；艾科灵锐2血糖测试仪(艾康生物技术有限公司)。

1.3 试剂 太子参药材(福建柘参种业有限公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；生理盐水(北京三药科技开发公司)；链脲佐菌素(批号：S0130、SIGMA-ALDRICH公司)；柠檬酸(批号：15070701、西陇化工股份有限公司)；柠檬酸钠(批号：1811291、西陇科学股份有限公司)；三氯乙醛水合物(批号：C10323759、MACKLIN)；重组人表皮细胞生长因子外用溶液(批号：20190204、深圳市华生元基因工程发展有限公司)。

1.4 试剂配制方法

①太子参多糖，临用时用生理盐水配制成所需浓度的太子参多糖溶液。2 g太子参多糖，用50 ℃生理盐水溶解，定容至10 mL；4000 r离心15 min，取上清，制备成0.20 g/mL的太子参多糖溶液。

②10%水合氯醛溶液制备：取5 g水合氯醛，于烧杯中加适量无菌生理盐水溶解后，定容至50 mL。0.22 μm滤膜过滤后备用。

③枸橼酸钠缓冲溶液的配制:柠檬酸(FW：210.14)2.1 g加入双蒸水100 mL中配成A液。柠檬酸钠(FW：294.10)2.94 g加入双蒸水100 mL中配成B液。用时将A、B液按1∶1的比例混合，PH计测定PH值，调节PH=4.2-4.5，0.22 μm滤膜过滤，即是0.1 mmol/L的枸橼酸钠缓冲液。

④链脲佐菌素溶液的配制:以0.1 mmol/L的枸橼酸钠缓冲液(PH=4.2-4.5)，在4℃条件下，将链脲佐菌素配制成1%STZ溶液，现用现配。

2 方法

2.1 太子参多糖提取 取太子参粉碎(过20目筛)，置于圆底烧瓶内，加入90%乙醇(1∶5，m/v)，室温下浸泡1 h。80℃加热，回流提取2次，每次1.5 h。经纱布过滤，滤渣挥干乙醇，装入纱布袋，置于中药提取罐，按料液比1∶9加入蒸馏水，浸泡1 h，100℃提取2 h后，过滤。重复提取两次，合并两次滤液，减压蒸发浓缩至生药量约0.5 g/mL。浓缩液加入乙醇调至终浓度为90%乙醇醇沉。4℃环境下沉淀24 h后，弃去上层乙醇液，-80℃冰箱冷藏后，真空冷冻干燥，得太子参多糖粉末。临用时取2 g太子参多糖，用50℃生理盐水溶解，定容至10 mL；4000 r离心15 min，取上清，制备成0.20 g/mL的太子参多糖溶液。

2.2 大鼠糖尿病足溃疡模型的制备 4周龄Wistar雄性大鼠32只，体重(180±20)g，清洁级，适应性饲养3天后用于实验。大鼠禁食不禁水12 h后，称重，尾静脉采血测大鼠基础血糖。随机选取24只大鼠，以40 mg/kg的剂量，给予1%STZ溶液左下腹注射，制备大鼠高血糖模型。剩余8只作为空白对照组，给予等剂量0.1 mmol/L枸橼酸钠缓冲溶液腹腔注射。注射72 h后 连续3 d监测空腹血糖，依据《辅助降血糖功能评价方法》的标准以血糖值在10～25 mmol/L为高血糖模型成功大鼠。

采用腹腔注射10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g麻醉大鼠后，于大鼠的足背皮肤，用印章作一3 mm×7 mm矩形标记，切除全层皮肤，75%酒精棉球消毒创面，形成缺损性足部皮肤溃疡大鼠模型。

2.3 分组及给药 32只Wistar雄性大鼠分为4组，其中空白对照组8只，其余24只高血糖模型大鼠随机分为模型组、金因肽外用阳性组、太子参多糖外用组，每组8只。空白对照组大鼠给予等体积生理盐水外用，模型组大鼠给予等体积生理盐水外用，金因肽外用阳性组大鼠给予重组人表皮细胞生长因子外用溶液局部均匀喷湿创面，每日1次，约4000 IU/10×10 cm2，太子参多糖外用组大鼠足溃疡创面给予太子参多糖外涂，每天2次。

2.4 大鼠糖尿病及糖尿病足溃疡模型指标测定

2.4.1 血糖 测定大鼠连续给药周期内监测其空腹血糖的变化情况，每隔7 d，各组均禁食不禁水6 h，尾静脉采血，血糖仪测定空腹血糖值。

2.4.2 大鼠体征的观察及体重测定 观察大鼠是否出现多饮、多食、多尿、体重减轻的“三多一少”症状。连续给药周期内，每隔7 d监测一次体重并进行记录。

2.4.3 大鼠糖尿病足溃疡创面监测 观察各组大鼠创面愈合的情况，每隔7 d对大鼠足溃疡创面愈合情况进行拍照记录。采用Image-pro plus图像处理分析软件获取JPEG格式图像数据，评估创面愈合情况。使用颜色及对比度滤镜增强图像后，依据创面呈红色与背景肤色的区别，选取红色创面为测量区域，测量创面面积，计算创面愈合率。

创面愈合率=(原始创面总面积-未愈创面面积)/原始创面总面积×100%

2.5 统计学分析 采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠体征的观察及体重测定 造模组大鼠体型消瘦，倦怠乏力，毛发黯淡发灰，出现多饮、多食、多尿、体重减轻的“三多一少”症状。

3.2 大鼠空腹血糖结果 大鼠连续给药后第7 d及第14 d，各组均禁食不禁水 6 h后，尾静脉采血，血糖仪测定大鼠空腹血糖值。由表1可见，造模后治疗前即0 d，空白对照组大鼠平均血糖(4.43±0.52)处于正常水平，但模型对照组大鼠平均血糖(16.94±4.09)，证明高血糖大鼠造模成功。太子参多糖外用治疗大鼠足溃疡7day和14day，空白对照组大鼠平均血糖分别为(4.46±0.50)和(4.59±0.43)均处于正常水平；但模型组、阳性对照组、太子参多糖治疗组大鼠血糖一直维持在(18.96±6.13)～(23.48±5.13)较高水平；给药周期内，高血糖大鼠血糖值仍然处于较高水平，即外用金因肽和太子参粗多糖并不能降低高血糖大鼠血糖值，同时高血糖大鼠血糖值也无自然恢复。

组别0d7d14d空白组4.43±0.524.46±0.504.59±0.43模型组16.94±4.0918.96±6.1322.23±4.45金因肽外用阳性组19.36±3.9322.63±7.7823.61±3.43太子参粗多糖外用组17.71±3.1322.58±4.9223.48±5.13

3.3 大鼠糖尿病足溃疡创面愈合结果 由图1可知，造足部溃疡模型后，各组大鼠溃疡创面鲜红，可见明显的炎性脓液渗出。造模后第7 d，空白组创面结痂脱落，伤痕收缩红活；模型组创面结成黄褐色痂，且创面仍有稀薄脓性分泌物；阳性组和多糖外用组创面结成红褐色痂，创面收缩。造足部溃疡模型后第14 d，空白组创面全部愈合，足部留有淡淡的伤痕；阳性组创面大多愈合，创面有干燥皮屑脱落；多糖外用组创面基本愈合，少有一点黑星小痂；模型组创面大都留有红褐色结痂。采用Image-pro plus图像处理分析软件计算各组大鼠创面愈合率，由表2、图2可知，给药后第14 d，各组大鼠创面基本愈合。给药周期内各组大鼠足溃疡创面愈合的效果为，空白组好于金因肽外用阳性组、好于太子参多糖外用组好于模型组。造足部溃疡模型后，空白组的正常动物创面结痂和愈合速度明显快于糖尿病动物，表明高血糖影响大鼠足溃疡创面的愈合。太子参多糖外用组及阳性组结痂和愈合速度明显快于模型组，与模型组相比，差异具有非常显著统计学意义(P<0.01)，说明了太子参多糖具有促进高血糖大鼠足溃疡创面愈合的药效。

组别例数Day7Day14空白组879.82%±0.05**100.00%±0.00**模型组847.34%±0.1388.33%±0.07金因肽外用阳性组868.32%±0.11**△99.90%±0.003**△20%太子参粗多糖外用组865.13%±0.09**△98.62%±0.02**△

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；阳性对照与治疗组相比，△P>0.05。

4 讨论

糖尿病可引起神经和血管损伤，持续高血糖可导致基于周围神经病变的全身性多部位神经损伤，使糖尿病患者肢端缺血和对伤痛的感觉不灵敏，增加了糖尿病足溃疡这一并发症出现的风险。持续高血糖会导致上皮细胞功能障碍，导致促血管生成信号和一氧化氮生成减少。此外，高血糖患者白细胞功能受损，免疫功能受损，相关部位免疫应答不足，使糖尿病足这一糖尿病常见并发症更难愈合[12]。

实验型糖尿病足溃疡动物模型的制备多是在糖尿病模型的基础上配合外部干预建立的。链脲佐菌素这一药物对哺乳动物的胰岛β细胞有特异毒性，造成胰岛素分泌低下，引起实验性糖尿病，此药物性糖尿病模型制备操作简便，成模周期短，被广泛用于诱导糖尿病动物模型。链脲佐菌素的注射剂量是决定糖尿病模型成功与否的关键，一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg以上剂量，大鼠胰岛细胞大量被破坏，血糖迅速升高，极容易造成死鼠，不利于对糖尿病进一步研究；40 mg/kg以下剂量造模血糖上升趋势缓慢，成模率低，其可能处于胰岛素抵抗早期，胰岛β细胞为代偿胰岛素抵抗而分泌更多的胰岛素进而控制血糖上升。本实验以40 mg/kg的剂量，给予1%STZ溶液左下腹注射，制备大鼠高血糖模型。造模后大鼠血糖一直维持在较高水平[(16.94±4.09)～(23.61±3.43)]，出现多饮、多食、多尿、体重减轻的“三多一少”症状，符合临床糖尿病患者的病症特征；进而于高血糖大鼠足背部切除一矩形全层皮肤组织，建立糖尿病足溃疡模型[13]。

目前难治性糖尿病足溃疡还没有理想的特效药，植物多糖具有皮肤组织修复等作用，同时可提供湿性愈合环境加速创面愈合。本文通过空白组、模型组、金因肽外用阳性组、太子参多糖外用组大鼠足溃疡创面愈合率的对比，证明了太子参多糖具有促进高血糖大鼠足溃疡创面愈合的药效，为中药太子参进一步开发和利用提供了新的思路。