PROX1-AS1和PRICKLE2-AS1基因多态性与中国汉族人群2型糖尿病的相关性*

陶文玉，李传印，杨莹，杨曼，王晓苓，角铭，何思琦，洪超，李奕平**

(1.云南省第二人民医院 &昆明医科大学第四附属医院 内分泌代谢科，云南 昆明 650021；2.中国医学科学院 &北京协和医学院，医学生物学研究所，云南 昆明 650118)

最新流行病学数据显示，中国糖尿病发病率已达10.9%[1]，T2DM个体约占糖尿病总数的90%以上。研究发现，T2DM可能是由遗传和环境因素共同导致[2]。人类基因组序列中75%具有转录活性[3]，而基因组转录产物中非编码RNA(non coding RNA，ncRNA)占绝大多数[4]。长链非编码RNA基因(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt ncRNA，可作为信号分子参与转录调控、RNA蛋白复合物在胞质的定位以及分子装配等多种生物学过程以及基因表达调控[5-6]，目前已成为疾病的新型生物标记分子或治疗靶点[7]。研究显示 lncRNA在糖代谢中发挥重要生物学作用[8-10]，而在T2DM和非糖尿病患者中lncRNA存在表达差异[11]。位于lncRNA基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)可通过影响lncRNA的结构和稳定性，影响其表达或改变其功能，这可能会影响疾病易感性[12-13]。近年来，全基因组关联分析(genome-wide association studies，GWAS)结果已显示lncRNA基因多态性可能与T2DM相关[14-15]。本研究选取PROX1-AS1基因rs2075423和PRICKLE2-AS1基因rs12497268的lncRNA多态性位点，分析其与中国汉族人群T2DM发病风险的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

随机选取2012年2月-2018年2月在云南省第二人民医院内分泌科住院的784名T2DM患者(男495例、女289例)为T2DM组，根据世界卫生组织(WHO，1999年)诊断标准：(1)糖尿病症状+空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)≥7.0 mmol/L或餐后2 h血浆血糖≥11.1 mmol/L，(2)若无糖尿病症状，需两次血糖检测异常。随机选取846名参加体检的非糖尿病个体(男503、女343)作为对照组，排除标准：(1)FPG≥6.1 mmol/L和(或)糖化血红蛋白(glycosylated haemoglobin，HbA1C)≥6.2%的个体，(2)糖尿病家族史阳性个体，(3)高血压病和冠状动脉粥样硬化性心脏病个体。本研究在实施前获得了医院伦理委员会的批准。所有参加者均是中国汉族，实验前均签署知情同意书，相互之间无血缘关系。

1.2 研究方法

1.2.1临床实验室检测项目 空腹12 h清晨抽静脉血，采用HITACHI 自动分析仪7600-020测定FPG；用酶法测定总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)；免疫比浊法测定HbA1C。

1.2.2DNA提取 使用血DNA提取试剂盒(QIAamp Blood Mini Kit，Qiagen)抽提基因组DNA。

1.2.3基因型测定 采用质谱法(MassArray Analyzer 4.0,Agena,Inc)对PROX1-AS1基因rs2075423，PRICKLE2-AS1基因rs12497268基因型进行分型，采用AssayDesigner 3.1(Sequenom lnc.,San Diego,CA,USA)设计待检SNP的PCR引物。待检SNP基因片段的PCR反应在384孔板中进行，反应体系为5 μL(PCR混悬液4 μL及25 mg/LDNA模板1 μL)。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共45个循环，最后72 ℃ 长延伸3 min。PCR反应产物经虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)处理，进行单碱基延伸反应。反应产物经树脂纯化后使用MassARRAY Nanodispenser RS1000设备(Agena,Inc,San Diego,CA,USA)将终产物转到SpectroCHIP的384孔反应板。使用MALDI-TOF质谱分析仪(Agena,Inc,San Diego,CA,USA)对SpectroCHIP结果进行读取，TYPER4.0 s软件获得原始基因型数据。为保证质谱分析法对基因型检测的准确性，每一块384孔反应板中加入3个已知基因型(野生纯合子、突变纯合子、杂合子)的标准样品作为阳性对照，同时，用水代替DNA模板作为阴性对照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 入选个体的临床特征

入选个体的临床特征见表1。T2DM组和对照组年龄和性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。T2DM组个体的糖脂代谢指标(TC、TG、LDL-C、FPG及HbA1C)显著高于对照组个体；而HDL-C显著低于对照组个体，差异有统计学意义(P<0.05)，提示糖脂代谢紊乱为T2DM的特征。

2.2 rs2075423及rs12497268等位基因和基因型在两组中的分布特征

PROX1-AS1基因中的rs2075423位点及PRICKLE2-AS1基因中的rs12497268位点的等位基因频率和基因型频率在两组中的分布特征见表2。哈-温平衡分析显示，2个SNP位点在对照组和T2DM组均符合哈-温平衡(P>0.05)，说明本研究样本符合群体代表性。对2个SNP位点等位基因和基因型在T2DM组合对照组的分布差异分析的结果显示，PROX1-AS1基因rs2075423的等位基因和基因型频率在T2DM组和对照组比较，差异有统计学意义(P<0.001或P=0.002)，该为点等位基因G可能是T2DM发生的风险因素(OR=1.394,95%CI为1.153～1.686)。而PRICKLE2-AS1基因rs12497268基因型频率及等位基因频率在T2DM组和对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 T2DM组和对照组一般临床资料比较Tab.1 The clinical characteristics of the subjects in T2DM and control groups

2.3 显性遗传模式下rs2075423及rs12497268与T2DM的相关性

采用逻辑回归方法分析PROX1-AS1基因中多态性位点rs2075423及PRICKLE2-AS1基因中多态性位点rs12497268在显性遗传模式下与T2DM的风险的相关性。结果显示，再现性遗传模式下，rs2075423位点的基因型G/G相对于基因型G/T+T/T来说可能是T2DM的风险因素(P<0.001,OR=1.488;95%CI为1.197～1.851)。同样，在显性遗传模式下，rs12497268位点基因型G/G相对于基因型基因型G/C+C/C来说可能是T2DM发生的风险因素(P=0.027,OR=1.260;95%CI为1.027～1.545)，见表3。

3 讨论

T2DM是多基因遗传的代谢性疾病，大量研究已经证实ncRNA在T2DM发生、发展中扮演重要作用[17-18]，同时，相关性研究显示位于ncRNA基因的SNP位点可能与糖尿病的发生发展具有相关性[19-21]。2012年，以欧洲人群为主要研究对象，Morris等[22]对34 840例T2DM个体和114 981例对照的联合meta分析提示，PROX1-AS1基因rs2075423等位基因G为T2DM的危险因素(P=8.1×10-9;OR为1.07,95%CI为1.05～1.10)。2014年，对4个群体(欧洲人群、东亚人群、南亚人群、墨西哥和墨西哥裔美国人群)GWAS的meta分析总结提示，无论是以上4个群体中任何1个群体，还是4个群体的联合分析，rs2075423G均为T2DM的风险等位基因[23]。不仅是病例对照研究，同年，欧洲癌症和营养状况前瞻性队列研究也报道，rs2075423等位基因G发生T2DM的风险比为1.03。本研究分析了该SNP与中国汉族人群T2DM发生风险的相关性，结果显示PROX1-AS1基因rs2075423等位基因G可能是T2DM的风险因素。以上研究结果说明lncRNAPROX1-AS1基因rs2075423可能与T2DM发生风险相关，鉴于PROX1-AS1为非编码RNA，因此本研究推测rs2075423位点与T2DM发生风险相关的分子机制可能是通过影响lncRNAPROX1-AS1的表达或其与靶基因的相互作用。

表2 PROX1-AS1基因中rs2075423位点及PRICKLE2-AS1基因中rs12497268位点的等位基因和基因型在T2DM组和对照组的分布特征Tab.2 The allelic and genotypic distribution of rs2075423 and rs12497268 in T2DM and control groups

表3 显性遗传模式下PROX1-AS1基因中多态性位点rs2075423及PRICKLE2-AS1基因中多态性位点rs12497268Tab.3 rs2075423 and rs12497268 with T2DM under dominant inheritance pattern

注：(1)P值经年龄和性别校正。

而2012年，Morris等[22]对欧洲人群的研究显示，PRICKLE2-AS1基因rs12497268等位基因G是T2DM的危险因素(P=2.1×10-2,OR=1.03;95%CI为1.01～1.07)。而本研究结果显示，该位点等位基因可能与中国汉族人群T2DM发生风险无相关性。相似地，2019年，Kasuga等[24]对日本213名妊娠期糖尿病个体产前、产后葡萄糖耐受情况及其遗传特征进行了分析，结果显示，遗传特征可能是日本妇女妊娠糖尿病的风险因素之一，而rs12497268妊娠糖尿病无相关性。以上研究结果的不一致说明rs12497268在不同人群中发挥的作用可能不同，除此之外，不同研究纳入样本量的差异也有可能会对结果产生影响。因此，该位点在T2DM发生过程中发挥的作用需要更多的相关性研究来揭示。

综上所述，本研究选取了两个lncRNA基因中的SNP位点，研究其与中国汉族人群T2DM发病风险的相关性。结果显示PROX1-AS1基因rs2075423等位基G因和基因型G/G以及PRICKLE2-AS1基因rs12497268 基因型G/G可能是T2DM发生的风险因素。本研究结果说明，lncRNA基因中的SNP位点可能与T2DM的发生风险相关，这可能是通过影响成熟lncRNA的表达以及改变lncRNA的功能实现的。鉴于lncRNA在T2DM发生发展过程发挥重要作用，而lncRNA基因中的SNP位点可能会影响lncRNA在T2DM发生发展过程中发挥的作用，因此，lncRNA基因中的SNP位点有望成为T2DM的分子标记之一。