人参皂苷Rd对U251神经胶质瘤细胞凋亡的影响*

楚丽丽，宛蕾

(贵州医科大学 基础医学院 药理教研室,贵州 贵阳 550004)

人参皂苷Rd(ginsenoside Rd,GS-Rd)是从中药人参中分离的单体成分，属于稀有皂苷，在三七中约含0.36%～1.47%[1]，可由人参皂苷Rb-1经肠道酶代谢获得，是皂苷经肠道吸收利用的形式之一。人参皂苷Rd具有抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡和分化、抑制其生长和转移的作用；还可抗疲劳、调节中枢神经系统、改善心脑血管、提高机体免疫力[2-7]。此外，还有提高学习能力、抗衰老[8-9]、抗溃疡性结肠炎[10]、抗肝纤维化[11和抗炎镇痛[12-14]等作用。神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，发病率约占脑肿瘤的46%[15]，5年生存率不超过5%[16]，预后差易复发[17]。目前此病的发病机制尚不完全清除，其发生发展过程受多因素多步骤影响[18]。传统治疗方法以手术及术后放化疗为主，但此肿瘤呈侵袭性生长，完全清除难度高，且目前使用的放化疗药物对机体正常组织造成伤害的同时易产生耐药性[19]。人参皂苷Rd属脂溶性小分子物质，生物活性较强，对正常细胞无毒，在诱导大肠癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等细胞凋亡方面的研究已有报道，但对治疗胶质细胞瘤方面尚未见报道。因此本研究通过观察人参皂苷Rd对神经胶质瘤U251细胞凋亡的影响并探讨可能的机制，为其在神经胶质瘤治疗中的应用提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验药物：人参皂苷Rd(纯度90%以上)，贵州信邦制药股份有限公司。细胞株：U251细胞系购于中国科学院上海细胞库。试剂：MTT(四甲基偶氮唑蓝)购自北京鼎国生物技术有限责任公司，1,2-丙二醇(批号930309)，购自重庆东方试剂厂，Hoechst33258(碧云天生物技术研究所)，兔抗CyclinD1单克隆抗体(批号13670111)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。仪器：荧光倒置显微镜(OLYMPUS IX71，日本)，流式细胞仪FACS-Cabiber(美国BD)。

1.2 试验方法

1.2.1细胞培养 U251细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，2～3 d换液1次。

1.2.2Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡 实验分空白对照组和低(20 μmol/L)、中(40 μmol/L)、高(80 μmol/L)剂量人参皂苷Rd组。将即用型细胞爬片放入6孔板中，U251细胞以2×107/L密度均匀接种于玻片上培养，低、中、高剂量人参皂苷Rd干预48 h，经 Hoechst33258染色后在荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.3流式细胞术Annexin-V FITC/PI双染检测细胞凋亡率 U251细胞给药处理48 h后收集，冷PBS液洗涤后离心弃上清，加入Binding Buffer继续离心弃上清，样本管加AnnexV-FITC 2.5 μL、PI 2.5 μL，并加入细胞悬液 100 μL，室温避光孵育15 min。空白对照管只加入细胞悬液100 μL，使用FACSCalibur流式细胞仪(美国 BD公司)收集细胞 30 000个，Cellquest 软件分析检测细胞凋亡率。

1.2.4流式细胞术PI染色检测细胞周期 接种细胞2×109/L，17 h后细胞贴壁生长后给予不含血清的高糖DMEM溶液培养24 h，给予低、中、高剂量人参皂苷Rd处理48 h。收集细胞密度达到 1×109/L，加入PBS 1.0 mL 混匀，1 000 r/min 离心5 min，弃上清；冷PBS液洗涤2次，再以2 000 r/min，室温离心5 min。弃上清后加入含RNase A的PI染液l mL，37 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5免疫细胞化学法检测CyclinD1蛋白表达 采用PV二步免疫组化法染色：消化细胞并计数，将细胞以2×107/L密度接种于预先放置细胞爬片的6孔板中，置 37 ℃培养箱中孵育，各组给予相应处理后取出细胞爬片自然干燥，4%多聚甲醛室温固定30 min、0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；用0.3% TritionX-100 PBS液通透细胞膜10 min、0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；3% H2O2去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；分别滴加兔抗人CyclinD1抗体，置于湿盒内4 ℃过夜；次日取出湿盒室温下复温60 min、0.01 mol/L PBS 洗5 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min、0.01 mol/L PBS 洗5 min×4次；滴加新鲜配置的DAB显色7 min，自来水充分冲洗终止染色；之后浸入苏木素染色液复染20 s，自来水冲洗终止复染；梯度酒精脱水(70%、80%、90%、95%、100%)，二甲苯溶液透明5 min×2次，中性树胶封片，倒置显微镜下观察拍片并对结果进行统计学分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组间比较用单因素方差分析进行统计学处理，两两比较采用t检验；P<0.05和P<0.01认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hoechst33258荧光染色检测人参皂苷Rd对U251神经胶质瘤细胞凋亡的影响

Hoechst33258染色结果显示，空白对照组有少量U251细胞细胞核呈致密的强荧光团影并出现胞核碎块，即出现少量凋亡细胞；人参皂苷Rd低、中、高剂量组细胞荧光强度增强且随着浓度的增加，细胞的上述改变越明显，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1、图2。

注：A为空白对照组，B为低剂量组，C为中剂量组，D为高剂量组，箭头所示为细胞凋亡小体。图1 Hoechst33258荧光染色检测人参皂苷Rd对U251细胞凋亡的影响(200×)Fig.1 The effect of ginsenoside Rd on U251 cell apoptosis by Hoechst33258 fluorescence staining(200×)

2.2 流式细胞术Annexin-V FITC/PI双染检测人参皂苷Rd对U251神经胶质瘤细胞凋亡率的影响

人参皂苷Rd处理之后U251细胞的损伤中以早期凋亡细胞为主，低、中、高剂量组随着药物浓度的增加细胞早期凋亡率也随之增加，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.1)。见图2。

注：(1)与空白对照组比较，P<0.01。图2 Hoechst33258荧光染色、流式细胞术Annexin-V FITC/PI双染检测人参皂苷Rd对U251细胞凋亡率的影响Fig.2 The effect of ginsenoside Rd on apoptotic rates by Hoechst33258 fluorescence staining and Annexin-V FITC/PI staining

2.3 人参皂苷Rd对U251细胞周期的影响

低、中、高剂量组U251细胞G0/G1期比例随药物浓度增加逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较，低、中剂量组S期所占比例降低，低、中、高剂量组G2/M期所占比例降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：与空白对照组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。图3 人参皂苷Rd对U251细胞周期的影响Fig.3 The effect of ginsenoside Rd on U251 cell cycle

2.4 人参皂苷Rd对U251神经胶质瘤细胞CyclinD1蛋白表达的影响

低、中、高剂量组作用于U251细胞后，倒置显微镜下观察CyclinD1阳性表达部位在细胞核，免疫组化方法染色呈棕黄色。结果显示，空白对照组中CyclinD1蛋白表达颜色深，且细胞表达数目多；而人参皂苷Rd低、中、高剂量组，CyclinD1蛋白表达颜色变浅，与空白对照组相比，低剂量组、中、高剂量组且细胞表达数目均减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、图5。

3 讨论

目前研究表明，肿瘤发生和细胞周期进程有密切联系[20-21]，也就是说肿瘤是一类细胞周期性疾病。细胞周期蛋白在细胞周期进程中G1-S、G2-M转换的两个关卡进行调控，其中G1期是决定细胞周期长短的限速期，细胞一旦跨过此点，反复进入细胞周期，直接导致细胞恶性增殖，这是发生肿瘤的根本原因。CyclinD1参与细胞周期G1到S期的转换[22]，起着重要的正性调控作用，在肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的作用。CyclinD1最早出现于G1期早期，正常情况下呈一过性表达；但是过度表达时可与CDK4/CDK6形成蛋白复合物，激活CDK4和CDK6的活性，蛋白激酶磷酸化失活，使细胞增殖对有丝分裂原的依赖性降低，周期调节失控G1期缩短、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡[23]，最终发生癌变[24-25]。由此可见，CyclinD1表达减少能有效抑制CyclinD-CDK4/CDK6复合物生成，从而不能越过G1期限制点，将细胞阻滞在G0/G1期，不能由静止状态进入细胞周期，影响细胞增殖。本研究显示，通过常用的血清饥饿法诱导U251细胞停留在G0期，给予Rd作用之后，随着药物浓度的增加，G0/G1期所占细胞周期的比例逐渐增加，S期也一定的下降趋势，同时CyclinD1表达率也逐渐下降。与上述通过CyclinD1表达减少，使其不能越过G1限定点，并将细胞阻滞于G0/G1期，使细胞周期发生紊乱相吻合。

注：与空白对照组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。图4 人参皂苷Rd对U251细胞CyclinD1蛋白表达的影响Fig.4 The effect of ginsenoside Rd on the expression of CyclinD1egg white in U251 cells

注：A为空白对照组，B为低剂量组，C为中剂量组，D为高剂量组，箭头所示为CyclinD1阳性表达。图5 人参皂苷Rd对U251细胞CyclinD1蛋白表达的影响(PV，×200)Fig.5 The effect of ginsenoside Rd on CyclinD1 expression(PV，×200)

综上所述，人参皂苷Rd可以有效的抑制神经胶质瘤U251细胞的增值，并将细胞阻滞在G0/G1期，其作用可能是通过下调CyclinD1的表达有关，但具体的分子机制需要进一步完善。本实验研究为开发人参皂苷Rd成为新的治疗神经胶质瘤的候选药物提供了基本的实验依据。