刘 虎,温淦辉,李盛财,操玉涛,申玉春
(1.广东海洋大学水产学院,广东 湛江 524025;2.湛江市海洋生态与养殖环境重点实验室,广东 湛江 524025)
近年来,随着水产饲料中植物性成分所占比例逐渐增多,饲料受真菌毒素污染的几率越来越大。呕吐毒素,又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxunivalenol,DON),是一种B型单端孢霉烯族化合物,主要是由雪腐镰刀菌、串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌等真菌产生的低分子量次级产物,广泛存在于受污染的饲料中[1]。呕吐毒素化学性质稳定,不易在加工、储存及烹调过程中被破坏,需采用有效的降解处理方法将其去除。有研究表明,呕吐毒素不仅能引起水产动物食欲减退、体质减轻、代谢紊乱等症状而影响其生产性能[2],还能诱导细胞和器官改变,引起功能和形态障碍,从而降低机体免疫力[3]。
目前国内外主要采用物理吸附、化学处理和生物转化降解等方法去除呕吐毒素[4]。但是物理和化学方法降解效率不稳定,而且会破坏饲料中的营养成分,容易造成二次污染[5-6]。与传统的物理、化学方法相比,生物转化法可将DON转化为无毒或低毒性产物,并保证饲料适口性和避免营养流失,逐渐成为DON降解相关研究的热点[7]。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一类革兰氏阳性菌,具有耐高温、耐酸碱、稳定性高、生长繁殖迅速、抗逆性强等特点,能有效抑制许多致病菌的繁殖,保证宿主健康,是一种非常理想的生防制剂微生物[8]。生物解毒酶和生物活性剂T是由广东海大集团有限公司研发生产的两种具有生物表面活性功效的抗菌蛋白。本研究在芽孢杆菌作为微生物添加剂在水产饲料中的实际用量的基础上,设计不同浓度的解淀粉芽孢杆菌(106、107、108CFU/mL)、生物解毒酶和生物活性剂T进行组合配伍,利用酶联免疫吸附法(ELISA)测试不同配伍对DON的解毒效率,以期为降解饲料原料或饲料中的DON,提高饲料的安全性及扩大饲料原料的利用范围提供数据支持。
呕吐毒素标准品、解淀粉芽孢杆菌MZ-01(实验室分离保存菌种)、生物解毒酶和生物活性剂T、DON试剂盒(上海飞测生物科技有限公司)。
1.2.1 培养基的制备
胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA):琼脂粉8.0 g、胰蛋白胨大豆肉汤培养基12.0 g、蒸馏水400 mL,121℃高温灭菌备用。胰酪大豆胨液体培养基(TSB):胰酪大豆胨肉汤培养基6.0 g、蒸馏水200 mL,121℃高温灭菌备用。
1.2.2 解淀粉芽孢杆菌悬液的制备
取一定量菌种,加入到200 mL胰酪大豆胨液体培养基(TSB)中,放入恒温摇床震荡培养28 h。培养完成后取0.1 mL培养液滴加于试管中,取少量无菌水稀释到适当倍数,充分震荡。利用分光光度计在570 nm波长下测定OD值,当OD值为0.1时,菌液浓度为108CFU/mL。然后进行10倍梯度稀释,分别获得浓度为108CFU/mL(高浓度)、107CFU/mL(中浓度)和106CFU/mL(低浓度)3组菌液。
1.2.3 呕吐毒素浓度的检测
由上海飞测生物科技有限公司采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测样品中DON残留量,每组设置3个平行。
1.2.4 数据统计及分析
试验数据采用Excel、SPSS等软件进行计算和统计分析。各配伍对DON的解毒效率用降解率表示,按公式计算:
式中:DC——解毒率,%;W0——对照组样品中DON含量,μg/L;W1——处理样中DON残留量,μg/L。
将不同浓度的解淀粉芽孢杆菌(106、107、108CFU/mL)、生物解毒酶和生物活性剂T相互组合,并以蒸馏水为空白对照组,每组设置3个平行,共14种组合(生物解毒酶和生物活性剂T终浓度均为0.1 mg/mL),各组合见表1。
表1 解淀粉芽孢杆菌、生物解毒酶和生物活性剂T不同组合配伍表
由表2可以看出,各单品分别与DON(1 mg/mL)混合孵育后,DON浓度均有不同程度的下降,且存在显著差异(P<0.05),三种单品对DON的降解率在16 h时较8 h时显著升高(P<0.05)。
表2 各单品对DON的降解率
注:不同小写字母表示各列处理组之间有显著差异(P<0.05),不同大写字母表示同行处理组之间有显著差异(P<0.05)。下表同此。
Notes:Different lowercase letters indicated significant differences among the column treatment groups(P<0.05),while different uppercase letters indicated significant differences among the row treatment groups(P<0.05).The following tables were the same.
由表3可以看出,与生物解毒酶单品相比,不同浓度的芽孢杆菌和生物解毒酶组合对DON(1 mg/mL)的降解效果在8 h时均显著升高(P<0.05),且生物解毒酶+解淀粉芽孢杆菌(106CFU/mL)组在不同时期对DON的降解率都表现为最高。
表3 不同浓度解淀粉芽孢杆菌和生物解毒酶组合对DON的降解率
由表4可以看出,与生物活性剂T单品相比,不同浓度的解淀粉芽孢杆菌和生物活性剂T组合对DON(1 mg/mL)的降解率在8 h时均无显著差异(P>0.05),仅生物活性剂T+解淀粉芽孢杆菌(108CFU/mL)组在16 h时显示较高的降解率。
表4 不同浓度解淀粉芽孢杆菌和生物活性剂T组合对DON的降解率
由表5可以看出,与生物活性剂T和生物解毒酶的混合物相比,不同浓度的解淀粉芽孢杆菌与其组合对DON(1 mg/mL)的降解作用均有所降低,其中以解淀粉芽孢杆菌(106CFU/mL)和解淀粉芽孢杆菌(107CFU/mL)组较为显著(P<0.05),解淀粉芽孢杆菌(108CFU/mL)组仅在8 h时差异显著(P<0.05),在16 h时差异不显著(P>0.05)。
表5 不同浓度解淀粉芽孢杆菌、生物活性剂T和生物解毒酶三者组合对DON的降解率
由表6可以看出,所有的组合配伍均对DON有解毒作用,其中解淀粉芽孢杆菌和生物解毒酶组合对DON(1 mg/mL)的降解效果较好,且在解淀粉芽孢杆菌浓度为106CFU/mL时降解率最高。另外,不同组合配伍对DON的降解效率随时间的增加显著升高(P<0.05)。
表6 不同浓度解淀粉芽孢杆菌与解毒酶和生物活性剂T分别组合及三者组合对DON的降解率
目前,已有研究表明许多微生物对真菌具有拮抗作用,包括食品级的乳酸菌、枯草芽抱杆菌、无色菌、漆斑菌等,其主要作用是利用代谢产生有机酸或一些蛋白质类似物如环肽[9-10]、几丁质酶[11]等,从而抑制真菌的生长[12]。
芽孢杆菌是人们较早开始接触并研究的细菌之一,这类革兰氏阳性好氧型细菌内含多种酶系,能适应多种生活环境,同时作为人或动物的益生菌也能增强宿主机体免疫力[13]。谭剑等[14]从被污染的玉米原料中成功分离出枯草芽孢杆菌,并通过对菌株发酵培养及毒素降解实验发现该菌在发酵过程中分泌了一种胞外蛋白,可有效降解DON。本研究发现将解淀粉芽孢杆菌和DON共同孵育后,DON浓度显著降低,16 h时较8 h时的降解效率显著升高,表明解淀粉芽孢杆菌MZ-01对DON具有降解作用。Fuchs等[15]研究发现从瘤胃中分离得到的肠道厌氧菌群和芽孢杆菌组成的微生物群体可将DON结构中的C12/C13环氧基团水解成两个相邻的羟基,生成转化产物DOM-1以达到脱毒目的。另有研究表明,微生物可以将呕吐毒素结构中的3-OH基团氧化成3-酮基,产生3-酮基-DON,或形成可以解毒的同分异构体3-epi-DON[16-17]。本研究表明解淀粉芽孢杆菌MZ-01可在体外降解DON,但其降解的机理尚不清楚,仍需进一步研究。
已有的研究表明,微生物主要通过糖基化、氧化和乙酰化这三种途径将呕吐毒素转化为低毒或无毒形态[18]。1997年,Kimura等[19]发现单端孢甲-3-0-乙酰转移酶能催化DON 3号位乙酰化以达到解毒目的。2003年,Poppenberger等[20]发现了拟南芥(Arabidopsisthaliana)提取的UDP-糖基转移酶能催化葡萄糖,将UDP-葡萄糖转移到呕吐毒素的C3位的羟基上形成3-O-吡喃葡萄糖-4-DON,实现解毒。另有研究表明,生物解毒酶还可通过水解和异构化等方式作用于DON的C-12,13环氧基团、C-3羟基等位点进行生物降解[21-22]。在本研究中,两种表面活性剂(生物解毒酶和T)对DON均具有降低毒性的作用,且16 h时生物解毒酶的减毒效果最好;推测生物解毒酶可能通过改变毒素结构,将毒素转化为无毒性产物,以降低DON污染所带来的风险。
有关呕吐毒素类真菌毒素的酶法降解的研究,主要集中于新酶的发掘以及酶学性质的研究,大部分酶因为降解效率低、稳定性差等原因还处于研究阶段。随着测序技术的发展和成本的不断降低,利用高通量测序技术开展真菌毒素降解菌基因组信息的检测已逐渐成为一种主流方式[18],自从2012年Zhou等[23]发现菌株Devosia具有降解呕吐毒素的能力并上传至基因库之后,越来越多可降解真菌毒素的微生物基因组信息学被研究报道,不断丰富的基因信息库和基因组学技术的发展,为真菌毒素降解酶的发掘提供了新的策略。
另外,本研究发现不同浓度的解淀粉芽孢杆菌和生物解毒酶组合对DON的降解效果在8 h时均显著升高,且生物解毒酶+解淀粉芽孢杆菌(106CFU/mL)组在不同时期对DON的降解率都表现为最高,且低浓度的解淀粉芽孢杆菌更能促进解毒酶对DON的解毒作用。但不同浓度的解淀粉芽孢杆菌和生物活性剂T组合对DON的降解率在8 h时均无显著差异,仅生物活性剂T+解淀粉芽孢杆菌(108CFU/mL)组在16 h时显示较高的降解率。除此之外,不同浓度的解淀粉芽孢杆菌与生物解毒酶和生物活性剂T的组合对DON的降解作用均有所降低,推测解淀粉芽孢杆菌与生物解毒酶和生物活性剂T组合后可能会抑制其降解作用。已有研究表明,不同微生物、生物解毒酶和生物活性剂可以通过不同的机制清除DON。但具体的解毒机制、降解产物和产物毒性以及彼此间的相互作用还需进一步的研究。
无论是解淀粉芽孢杆菌、生物解毒酶或生物活性剂T单品,还是它们的组合配伍,对呕吐毒素均有一定的解毒作用,且随时间的增加而显著升高,这证实了微生物对呕吐毒素具有一定解毒效果的说法。而且在本研究中,生物解毒酶和解淀粉芽孢杆菌(浓度为106CFU/mL)组合对呕吐毒素降解率最高。