一种来源于米根霉的低温脂肪酶催化鱼油酯交换反应及其氧化性质的研究

许曦锃，倪瑞敏，林立敏，钟晓芳，傅 红，2*，叶秀云，2

(1.福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108；2.福建省海洋酶工程重点实验室，福建 福州 350108)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一类可催化酯类水解与合成等反应的生物催化剂[1]，已被广泛应用于食品、饲料、化工、医药等领域[2-4]。酯交换反应将天然的、容易被人体吸收的TG型鱼油，在脂肪酶的选择性催化下，与人工合成的富含ω-3脂肪酸的乙酯型(EE)鱼油，发生酰基转移反应，得到ω-3脂肪酸含量更高的TG型鱼油[5]。Yang Z等[6]研究了Novozyme 435在无溶剂体系中催化鱼肝油与EE型鱼油进行酯交换的条件，在最优条件下乙酯的转化率达到92.4%；刘芳[7]通过用水解反应得到的甘油酯与浓缩鱼油乙酯在真空条件下通过脂肪酶催化酯交换合成甘油三酯，在最佳条件下EPA和DHA的总含量为49.6%，提高了27.3%。目前，市售的商品化脂肪酶大部分为最适反应温度50℃左右的中高温脂肪酶，而最适温度在0～30℃范围内的低温脂肪酶的品种不多且其应用有限[8-9]。鱼油是富含ω-3多不饱和脂肪酸的重要功能性油脂，其中EPA和DHA具有提高婴幼儿智力发育、预防老年人动脉粥样硬化和老年痴呆等功效[10-12]。但天然鱼油中EPA和DHA的含量很低，并且鱼油对热加工条件极其敏感，因此，开发和应用低温脂肪酶可在一定程度上保障鱼油产品的氧化稳定性、营养价值和风味等。

本研究利用一种来源于米根霉的低温脂肪酶，在考察其水解、酯化及酯交换等各项催化性能的基础上，研究它对甘油三酯型和乙酯型鱼油酯交换反应的影响，并进一步研究酯交换反应产物的氧化特性，旨在为低温生物催化剂富集TG型鱼油的ω-3脂肪酸含量，减少工业化能源消耗，并为研究提高鱼油产品氧化稳定性提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TG型鱼油(EPA：17.71%、DHA：11.68%)、EE型鱼油(EPA：43.86%、DHA：34.06%)：福建高龙海洋生物工程有限公司；低温脂肪酶粗酶液：福州大学海洋酶工程重点实验室研发；Novozyme 435脂肪酶(10 000 PLU/g)：诺维信公司；薄层层析硅胶G(分析纯)：青岛海洋化工有限公司；对硝基苯酚、对硝基苯酚棕榈酸酯(分析纯)：麦克林生化科技有限公司；正己酸、三油酸甘油酯、正辛酸等均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC7890A气相色谱仪、112-88A7HP-88毛细管色谱柱(100 m×250 μm×0.20 μm)：美国Agilent公司；AVANCE NEO 600全数字化核磁共振波谱仪：瑞士 Bruker 公司；HH-501超级恒温水浴锅、HJ-4A磁力搅拌器：上海方瑞仪器有限公司；CF16RX-Ⅱ高速冷冻离心机：天美(中国)科学仪器有限公司。

1.3 脂肪酶活力的测定

低温脂肪酶水解活力测定采用对硝基苯酚法[13]；酯化活力测定采用滴定法[14]；酯交换活力测定采用气相色谱法[15]。

1.4 脂肪酶催化鱼油酯交换反应

以TG型鱼油与EE型鱼油为反应底物，添加适量脂肪酶(以底物质量计%，W/W)于双层烧杯中混匀反应。加入乙醇和丙酮终止反应，离心除酶，用薄层层析法分离出甘油三酯[16]，经正己烷萃取后甲酯化[17]，利用气相色谱仪测定TG型鱼油中EPA和DHA含量。

脂肪酸组分的气相色谱分析条件[18]：载气为纯氮气，流速为1 mL/min，氢气为35 mL/min，空气为350 mL/min；进样口温度250℃，FID检测器280℃。程序升温：140℃保持5 min，以4℃/min程序升温到220℃持续保持35 min。

1.4.1 脂肪酶添加量对反应产物中(EPA+ DHA)含量的影响

试验设置TG型鱼油与EE型鱼油质量比为1∶1，反应温度30℃，反应时间24 h，酶添加量分别为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%。

1.4.2 底物质量比对反应产物中(EPA+ DHA)含量的影响

试验设置反应温度30℃，加酶量为0.9%，反应时间为24 h，TG型鱼油与EE型鱼油的质量比分别为2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2。

1.4.3 反应温度对反应产物中(EPA+DHA)含量的影响

试验设置加酶量为0.9%，TG型鱼油与EE型鱼油质量比为1∶1，反应时间为24 h，反应温度分别为20、25、30、35、40℃。

1.4.4 反应时间对反应产物中(EPA+DHA)含量的影响

试验设置TG型鱼油与EE型鱼油质量比为1∶1，温度为30℃，加酶量为0.9%，反应时间分别为6、12、18、24、30、36 h。

1.5 鱼油酯交换产物的氧化性质研究

1.5.1 氧化指标检测

鱼油酯交换产物的过氧化值(PV)检测方法参照GB/T 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[19]，茴香胺值(p-AV)检测方法参照GB/T 5009.181—2016《动植物油脂茴香胺值的测定》[20]。

1.5.2 核磁共振分析氧化产物的氢质子化学位移

取100 μL鱼油酯交换产物溶于600 μL氘代氯仿中，震荡5 s后装入直径5 mm的核磁管中，平衡5 min后测量[21]。

1H-NMR谱采集参数[22]：以TMS为内标物，化学位移以ppm为单位，扫描次数32次，脉冲宽度90°，采集时间2.752 5 s，谱宽12 ppm，脉冲间隔1 s，脉冲序列zg30。

1.6 数据处理

利用Excel、Origin 9.5和MestReNova 6.1软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 温度对脂肪酶活力及其热稳定性的影响

一般情况下，特定脂肪酶的水解、酯化和酯交换的酶活力并不相同，这是由其化学反应的微观差异导致的，传统方法测定的脂肪酶酶活力通常指的是其水解活力，但因反应体系是油与水的混合体系，因此其酶活力并不能代表酯化和酯交换的活力[23-24]。本研究在10～60℃范围分别考察低温脂肪酶的水解、酯化和酯交换的活力，结果如图1所示。由图1可以看出，此低温脂肪酶的三种催化反应的最适温度都为30℃，在室温范围(25～35℃)内具有的相对酶活力均在90%以上，表明它具有良好的低温反应活性，对生物催化某些热敏性脂类物质具有潜在的应用价值。

对经过10～60℃进行1 h热处理后的脂肪酶进行催化反应的残余酶活力测定，试验数据如图2所示。结果表明，低温脂肪酶在10～30℃的低温环境下能维持良好的稳定性，1 h热处理的残余酶活力在85%以上；而在40～50℃热处理1 h后，残余酶活力开始迅速降低；经60℃热处理1 h的残余酶活力不足20%，说明此脂肪酶热稳定性较差。根据低温脂肪酶的定义[25]，该脂肪酶属于低温脂肪酶范畴。

2.2 鱼油酯交换反应条件的确定

2.2.1 加酶量对鱼油酯交换反应产物中(EPA+DHA)含量的影响

当加酶量(以底物质量计%，W/W)为0.3%～1.5%时，研究鱼油酯交换产物TG中ω-3脂肪酸(EPA和DHA)的含量。从图3可以看出，当脂肪酶添加量为0.3%～0.9%时，产物TG中ω-3脂肪酸含量显著增加；当加酶量为0.9%～1.5%时，其增加趋势趋于平缓。这可能是因为在加酶量过多时，粗酶液中的水分促进了水解作用，抑制了酯交换反应的进行。因此研究选用0.9%低温脂肪酶添加量。

2.2.2 底物质量比对鱼油酯交换反应产物中(EPA+DHA)含量的影响

TG型鱼油与EE型鱼油的质量比(2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2)对鱼油酯交换反应产物中(EPA+DHA)含量的影响结果如图4所示。随着EE型鱼油比例的增加，(EPA+DHA)含量先增加后降低，当底物质量比为1∶1时，ω-3脂肪酸含量达到最高。按照化学平衡的原理，这主要是因为两种底物的酯交换反应在1∶1的质量比时达到化学平衡，能够得到相对稳定的高含量ω-3脂肪酸TG型产物。因此选取TG型鱼油与EE型鱼油质量比为1∶1进行后续研究。

2.2.3 温度对鱼油酯交换反应产物中(EPA+DHA)含量的影响

反应温度对鱼油酯交换的影响如图5所示，酯交换产物TG型鱼油的ω-3脂肪酸含量在反应温度为30℃时达到最大，为41.14%，在反应温度25℃时为37.47%，分别比原料TG型鱼油提高了11.75%和8.08%，可见此脂肪酶在室温范围内能很好地催化鱼油的酯交换反应。当反应温度继续升高到35～40℃时，产物TG中ω-3脂肪酸含量降低至36%，这可能是40℃左右的中高温就能破坏该酶的活性中心，产生不可逆变性结构，导致酶催化酯交换能力迅速下降。因此，该脂肪酶在低温条件下能够发挥其最大的酯交换催化活性，选取30℃的反应温度为宜。

2.2.4 时间对鱼油酯交换反应产物中(EPA+DHA)含量的影响

反应时间6～36 h对鱼油酯交换的影响，如图6所示。在反应时间为18 h时，酯交换产物TG型鱼油的ω-3脂肪酸含量最大，达到44.83%，比原料TG型鱼油提高了15.44%，表明液体脂肪酶与鱼油底物接触更充分，体系流动性大，有利于加快反应的进行。所以，该低温脂肪酶催化鱼油酯交换的反应时间以18 h为宜。

2.2.5 最优反应条件验证

试验设置低温脂肪酶添加量为0.9%，TG型鱼油与EE型鱼油质量比为1∶1，于30℃反应18 h，重复3次，获得最佳条件下鱼油酯交换产物TG中EPA和DHA含量为(44.83±0.30)%。

2.3 鱼油酯交换反应产物的氧化性质比较

在产物TG型鱼油ω-3脂肪酸含量基本相同的条件下，探究此低温脂肪酶和中高温脂肪酶Novozyme 435在不同温度反应下对鱼油品质带来的影响，反应条件和理化指标如表1所示。脂肪酶Novozyme 435在50℃酯交换所得鱼油产物氧化程度较大，过氧化值和茴香胺值分别是低温脂肪酶30℃催化的产物的1.6倍和2.6倍，这是因为鱼油富含ω-3多不饱和脂肪酸，在50℃加热时与空气接触更易发生热氧化反应，产生氢过氧化物以及引起人体有异常生理反应的醛、酮等有害物质，从而影响鱼油品质[26]。因此，30℃的热加工条件对鱼油品质的影响较小。

表1 鱼油酯交换条件及所得产物的理化指标

注：酯交换反应的时间为18 h，底物质量比为1∶1。

Note：The transesterification time was 18 h，and the substrate mass ratio was 1∶1.

利用高场核磁共振对鱼油中氢质子在不同环境下的化学位移进行研究，可以进一步反映鱼油氧化的变化，结果如图7所示。上述两种不同氧化程度的鱼油1H-NMR图谱在0～5.5 ppm处均有10个吸收峰，谱峰A～G的归属和对应的官能团，与文献报道[27]相符。低温脂肪酶于30℃催化酯交换所得的鱼油，在5.5～7.0 ppm与8.2～8.9 ppm处可见明显的共轭二烯物[28]和氢过氧化物[29]信号峰，而Novozyme 435于50℃催化反应所得的鱼油在9.0～10.2 ppm之间有更显著的醛类[28]吸收峰，这可能是因为50℃高温下鱼油的溶氧量增加，促进了初级氧化产生的共轭二烯物和氢过氧化物进一步降解形成次级氧化产物醛、酮等物质，因此与30℃低温相比，其热氧化程度较大。这说明了低温脂肪酶和Novozyme 435脂肪酶催化鱼油酯交换所得产物的氧化程度存在差异，低温脂肪酶的温度条件能较好地保障鱼油品质。

3 讨论

目前，我国应用的主要是进口脂肪酶，如丹麦诺维信公司、日本天野公司出售的多种脂肪酶，这些大多是反应温度在50～60℃左右的中高温脂肪酶，不仅在工业生产的使用中需加装热装置，增加能源消耗和生产成本，也会导致鱼油的酶法催化推广因脂肪酶的反应温度而受限。而低温脂肪酶在室温范围即可催化反应，不仅节约能耗，而且不会对鱼油品质造成不良影响。

本试验对一种来源于米根霉的低温脂肪酶进行研究，其水解、酯化和酯交换的最适温度均为30℃，在室温范围内热稳定性均较好。在催化TG型鱼油与EE型鱼油酯交换反应中，米根霉低温脂肪酶的加酶量为0.9%，底物质量比为1∶1，在30℃下反应18 h，其酯交换反应产物中EPA和DHA的总含量达到44.83%，较原料TG型鱼油提高近16%。低温脂肪酶进行酶法酯交换反应所需的温度条件易达，而且所需附加的热能低，因而其有望在绿色工业化生产中被加以利用，并突破鱼油商品生产中温度条件的瓶颈。

鱼油酯交换反应产物氧化性质的研究表明，当使用酯交换温度为30℃的低温脂肪酶时，鱼油氧化情况良好，而使用反应温度为50℃的中高温Novozyme 435脂肪酶时，鱼油发生明显的热氧化，降低了鱼油产品的质量。因此，低温脂肪酶对热敏性脂类氧化稳定性的保护，具有中高温脂肪酶不可比拟的优势，在催化鱼油酯交换反应制备高含量ω-3脂肪酸TG型鱼油中具有良好的应用潜力。

致谢：感谢“海洋生物酶工程创新服务平台2014FJPT02”对本试验的支持。