30份药食用桑叶营养品质评价及相关性研究

黄金枝，俞燕芳*，胡桂萍，石旭平，杜贤明，王军文，邓真华，曾萍芳

1(江西省蚕桑茶叶研究所，江西 南昌，330202)2(江西省经济作物研究所，江西 南昌，330202) 3(江西省蚕桑工程技术研究中心，江西 南昌，330202)

桑叶在《神农本草经》中被誉为“神仙叶”[1]，桑叶中含有生物碱、多酚、黄酮、多糖等多种活性成分[2]，具有降三高、抗病毒、预防衰老等多种疗效，享有“人参热补，桑叶清补”的美誉[3-6]。近年来，随着人们生活水平的提高，人们更加注重饮食健康，桑叶作为药食同源农产品之一，其开发的产品也深受人们的喜爱。目前关于桑叶药食用方面的报道逐年增加，但是桑叶的成分及含量受桑树品种、生长环境、桑叶部位等影响较大[7]。曾卫湘等[8]研究了53份桑种质桑叶的药用品质，测定了多糖、1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)和总黄酮的含量，结果表明不同品种间多糖、DNJ和总黄酮含量存在一定的差异。敬成俊等[9]研究了10份不同地理来源桑种质资源冬桑叶中的营养与活性成分含量，发现不同地理来源的桑叶中蛋白质、脂肪、多糖、黄酮、多酚和γ-氨基丁酸含量存在着显著差异。

江西省蚕桑茶叶研究所多年来收集和保存150多份国内外不同品种的桑树资源，并建立了桑树种质资源圃，其中多数品种的综合利用价值尚未进行有效成分评估。本次试验共采集30个桑品种的桑叶，测定并分析了多酚、黄酮、多糖、蛋白质、1-脱氧野尻霉素、主要酚类物质，为建立江西省桑树种质资源生化成分数据库奠定基础，同时为综合评估桑树种质资源的利用价值以及深入研究和开发桑资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采用的桑品种分别为修水青皮桑、白皮桑、富阳桑、铁叶鲁桑、白皮火桑、红皮大种、泰和毛桑、白皮大种、伍村2号、一之濑、修短大早桑、渣莲2号、育151、全丰2号、乌皮桑、越南桑、睦州青、望海桑、剑持桑、皱皮荷叶白、荷叶大种、豆腐皮、大十、湘7920、九纹龙、修水实生桑、白皮湖桑、麻皮桑、大墨斗、嘉定204，栽植于江西省蚕桑茶叶研究所桑树种质资源圃，每个品种随机采摘3份，采于2019年5月29日，取1年生枝条6～15位的新鲜叶片，将桑叶迅速带回实验室进行干燥处理，60 ℃烘干，粉碎，过60目筛，分装于不同的自封袋。

没食子酸、芦丁、DNJ标准品、芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)、绿原酸、异槲皮素、紫云英苷(astragalin,AG),上海阿拉丁生化科技有限公司；乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、NaNO2、Al(NO4)3、NaOH、Na2CO3、福林酚、HCl、硼酸、硼酸钾、甘氨酸、醋酸、甲基红、溴甲酚绿、亚甲基蓝(分析纯),西陇化工股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯),德国默克公司。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260II高效液相色谱,美国安捷伦公司；UV-2600紫外分光光度计,日本岛津公司；KQ2200E型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司；海能K9860全自动凯氏定氮仪、SH220F石墨消解仪,海能仪器股份有限公司；HH恒温水浴锅,金坛市中大仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱,上海添时科学仪器有限公司；水分仪,美国奥豪斯仪器有限公司；ST16R1台式高速冷冻离心机,北京联合科力科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 多酚含量测定

多酚提取方法参照黄金枝等[10]方法，并稍作修改。测定方法采用Folin-ciocalteu比色法[11-12]，以没食子酸标准品作标准曲线计算多酚的含量(y=0.373 8x+0.048 5，R2=0.999 2)。

1.3.2 黄酮含量测定

提取方法同1.3.1。测定方法采用亚硝酸钠-硝酸铝法，以芦丁为标准曲线计算黄酮含量(y=1.458 6x-0.016 7，R2=0.999)[13]。

1.3.3 多糖含量测定

称取桑叶粉0.1 g于250 mL锥形瓶中，加入沸水80 mL，沸水浴1 h，过滤，滤液转入100 mL容量瓶中，定容。测定方法采用苯酚-硫酸法[14]，以葡萄糖为标准曲线计算多糖含量(y=0.057 8x+0.001 1，R2=0.997)。

1.3.4 蛋白质含量测定

参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》。

1.3.5 DNJ含量测定

DNJ提取、柱前衍生及测定方法参照俞燕芳等[15]方法，稍作修改。以DNJ的质量浓度为纵坐标，峰面积为横坐标绘制标准曲线，得DNJ的标准曲线线性回归方程(y=3.495x+2.114，R2=0.999 9)。

1.3.6 桑叶酚类化合物含量测定

采用高效液相色谱法，参照俞燕芳等[15]方法，稍作修改。

液相色谱条件为：Agilent Eclipse XBD-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温30 ℃；进样量10 μL；流动相A为0.1%(体积分数)甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.8 mL/min。梯度洗脱程序为：0～20 min，5%～15%B；20～50 min，15%～35%B；50～60 min，35%～50%B；60～65 min，50%～100%B；每个程序后运行5 min。紫外检测器，检测波长360 nm。

1.4 数据统计及分析

用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS进行数据统计分析，结果均用重复试验的平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同品种间多酚含量的变化

由图1可知，不同品种间多酚含量的变化存在着显著性差异，多酚质量分数在15.98～150.30 mg/g之间，其中剑持桑中多酚含量最高，为150.30 mg/g；伍村2号中多酚含量最低，为15.98 mg/g；剑持桑中多酚含量是伍村2号的9.41倍。多酚类物质具有清除自由基和消除自由基毒性作用，在抗衰老、抗辐射、防治肿瘤及增强机体免疫力等方面也具有生物学功效[16]，剑持桑可以作为多酚类的药食产品开发原材料。

1-修水青皮桑；2-白皮桑；3-富阳桑；4-铁叶鲁桑；5-白皮火桑；6-红皮大种；7-泰和毛桑；8-白皮大种；9-伍村2号；10-一之濑；11-修短大早桑；12-渣莲2号；13-育151；14-全丰2号；15-乌皮桑；16-越南桑；17-睦州青；18-望海桑；19-剑持桑；20-皱皮荷叶白；21-荷叶大种；22-豆腐皮；23-大十；24-湘7920；25-九纹龙；26-修水实生桑；27-白皮湖桑；28-麻皮桑；29-大墨斗；30-嘉定204(下同)

2.2 不同品种间黄酮含量的变化

黄酮类物质是桑叶发挥功效的主要活性成分之一，具有多种生物学功能[17-19]。桑树是黄酮类物质含量较高的树种之一，其含量受桑树品种、生长环境、桑叶部位等影响。由图2可知，不同品种间黄酮含量的变化存在着显著性差异，黄酮质量分数在9.60～40.17 mg/g之间，其中越南桑中黄酮含量最高，为40.17 mg/g；白皮火桑中黄酮含量最低，为9.60 mg/g；越南桑中黄酮含量是白皮火桑中的4.18倍。越南桑可以作为黄酮类的药食产品开发原材料。

图2 不同品种间黄酮含量的变化

2.3 不同品种间多糖含量的变化

桑叶多糖是桑叶的主要功能活性成分之一，具有多种生物学活性，如降血脂血糖和抗氧化，在医药和食品方面应用广泛[20]。由图3可知，不同品种间多糖含量的变化存在显著性差异，多糖质量分数在139.21～317.64 mg/g之间，其中嘉定204中多糖含量最高，为317.64 mg/g；大墨斗中多糖含量最低，为139.21 mg/g；嘉定204中多糖含量是大墨斗中的2.28倍。嘉定204可以作为多糖类的药食产品开发原材料。

图3 不同品种间多糖含量的变化

2.4 不同品种间蛋白质含量变化

蛋白质是桑叶化学成分的主成分之一，占干物质含量的25%左右，通常作为判断叶质的指标[21]。由图4可知，不同品种间蛋白质含量的变化存在着显著性差异，蛋白质质量分数在15.94～22.73 g/100 g之间，其中全丰2号中蛋白质含量最高，为22.73 g/100 g；白皮桑中蛋白质含量最低，为15.94 g/100 g；全丰2号中蛋白质含量是白皮桑中的1.43倍。全丰2号可以作为蛋白质类的药食产品开发原材料。

图4 不同品种间蛋白质含量的变化

2.5 不同品种间DNJ含量的变化

桑叶中的主要功能活性物质之一——DNJ，对小肠中的α-葡糖苷酶活性具有很强的竞争性抑制作用[22]。由图5可以看出，不同品种间DNJ含量的变化存在着显著性差异，DNJ质量分数在5.90～24.58 mg/g之间，其中全丰2号中DNJ含量最高，为24.58 mg/g；九纹龙中DNJ含量最低，为5.90 mg/g；全丰2号中DNJ含量是九纹龙中的4.17倍。全丰2号可以作为DNJ类的药食产品开发原材料。

图5 不同品种间DNJ含量的变化

2.6 不同品种间酚类组成及成分含量的变化

图6为混合标准品(A)和越南桑桑叶样品(B)的酚类物质HPLC图谱。通过标准品对照和参考文献[23-24]，鉴定出桑叶样品中6种酚类化合物。绿原酸、芦丁、异槲皮素和紫云英苷(AG)是以相应的标准品制作标准曲线计算含量，槲皮素-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷(QMG)及山奈酚-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷(KMG)分别以异槲皮素和紫云英苷为参照计算含量。酚类组成及含量变化如表1所示。

由表1可以看出，绿原酸质量分数在1.03～1.46 mg/g之间，其中伍村2号绿原酸含量最低，越南桑中绿原酸含量最高；芦丁质量分数在0.12～1.31 mg/g之间，其中伍村2号中芦丁含量最低，越南桑中芦丁含量最高；异槲皮素质量分数在0.15～1.35 mg/g之间，其中伍村2号中异槲皮素含量最低，越南桑中异槲皮素含量最高；槲皮素-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷质量分数在0.17～1.59 mg/g之间，其中伍村2号中QMG含量最低，荷叶大种中QMG含量最高；紫云英苷质量分数在0.44～0.86 mg/g之间，伍村2号中AG含量最低，剑持桑中AG含量最高；山奈酚-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷质量分数在0.43～1.25 mg/g之间，其中大十中KMG含量最低，修水青皮桑中KMG含量最高。

1-绿原酸；2-芦丁；3-异槲皮素；4-槲皮素-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷；5-紫云英苷；6-山奈酚-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷

表1 不同品种间酚类化合物含量的变化 单位：mg/g

续表1

序号绿原酸芦丁异槲皮素QMGAGKMG91.03±0.090.12±0.010.15±0.010.17±0.010.44±0.020.46±0.03101.28±0.120.26±0.020.28±0.010.55±0.030.60±0.040.80±0.07111.15±0.060.32±0.010.48±0.031.01±0.040.60±0.020.73±0.05121.21±0.070.47±0.030.57±0.021.32±0.090.68±0.050.91±0.04131.29±0.050.42±0.020.65±0.041.54±0.110.74±0.031.11±0.09141.09±0.080.16±0.010.21±0.010.29±0.020.47±0.030.49±0.02151.17±0.110.25±0.010.44±0.030.89±0.070.61±0.030.73±0.05161.46±0.121.31±0.101.35±0.070.72±0.030.79±0.040.46±0.02171.22±0.090.38±0.020.33±0.011.06±0.070.70±0.050.98±0.03181.17±0.040.26±0.010.44±0.030.79±0.050.62±0.020.74±0.04191.31±0.020.72±0.31.21±0.080.51±0.030.86±0.020.46±0.02201.25±0.050.26±0.010.30±0.010.62±0.030.60±0.020.78±0.04211.29±0.110.40±0.020.70±0.031.59±0.070.77±0.011.01±0.05221.21±0.050.34±0.020.43±0.010.80±0.050.63±0.020.87±0.03231.23±0.050.50±0.010.68±0.040.31±0.010.67±0.030.43±0.02241.24±0.070.25±0.010.42±0.010.97±0.050.64±0.030.87±0.02251.22±0.030.39±0.010.54±0.051.05±0.030.72±0.020.99±0.03261.22±0.020.28±0.020.41±0.010.73±0.030.62±0.050.77±0.02271.25±0.060.31±0.030.52±0.020.72±0.050.60±0.030.68±0.02281.25±0.020.36±0.010.39±0.021.03±0.030.67±0.050.90±0.07291.21±0.070.42±0.020.56±0.011.01±0.050.69±0.010.94±0.03301.23±0.080.42±0.010.64±0.031.02±0.050.71±0.020.88±0.04

2.7 不同品种间各成分相关性

为了全面分析各指标间是否存在相关性，对不同品种间多酚、黄酮、多糖、蛋白质、DNJ、绿原酸、芦丁、异槲皮素、QMG、AG、KMG进行相关性分析，结果如表2所示。

表2 不同品种间各成分相关性

注：**在0.1水平上显著相关；*在0.05水平上显著相关

3 结论与讨论

本实验采用HPLC法、凯氏定氮法、紫外分光光度法和相关性分析法对桑叶的多酚、黄酮、多糖、蛋白质、DNJ及主要酚类物质进行测定分析，结果表明，不同桑品种桑叶营养及活性成分存在一定的差异。桑叶的品质是由多个因素综合来评价，仅由某一个或者几个成分很难全面客观地判断出桑叶的真实品质，并且各品质指标间既是相互独立的，又有相互作用的。桑叶的营养品质主要体现在多酚、多糖、黄酮、蛋白质和DNJ等多种营养与生物活性成分的组分和含量上，但不是针对某一特定的用途开展研究，且得出的结论也不同[25-27]。

通过研究发现，不同品种间桑叶多酚、黄酮、多糖、蛋白质、DNJ及主要酚类物质含量相差较大。对多酚、黄酮、蛋白质、多糖、DNJ和主要酚类物质进行相关性分析，发现各指标间具有一定的相关性。经评价分析，筛选出剑持桑、越南桑、嘉定204、全丰2号、荷叶大种和修水青皮桑等6份桑叶药食用优势资源。梁秋贵等[28]测定了广西蚕区21个桑树品种的蛋白质、多酚、黄酮、DNJ多糖、绿原酸、芦丁槲皮素等含量，发现各指标间存在着一定的相关性。其中蛋白质为影响桑叶营养品质的主要指标，多酚、多糖、黄酮、DNJ主要影响桑叶的保健品质。生产上可以根据桑叶的饲用性、食用性以及药用性选择不同品种的桑叶作为原料，使得桑叶功能性成分的利用效果达到最佳。