CDK1、CENPT和P53在乳腺癌中的表达及意义

赵若晗　史嘉翊　刘馨璥　宋洁

【摘要】 目的：研究CDK1、CENPT和P53在乳腺癌中的表达情况，探讨基因表达与乳腺癌患者生存率及病理阶段分型的关联性和调控关系。方法：GEPIA数据库分析乳腺癌和正常样本中的表达与总体生存率，乳腺癌患者基因表达与病理分期影响，CENPT与CDK1、BAX、BCL2、CASP3、P53的相关性分析，UALCAN数据库验证结果。敲减CENPT后，半定量PCR检测CDK1、BAX、BCL2、CASP3、P53在MCF7细胞系中的表达。结果：CDK1、CENPT在乳腺癌及正常组织表达比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;CDK1、BCL2表达与不同病理分期比较，差异有统计学意义（P<0.05）;P53不同表达乳腺癌患者总体生存率比较，差异有统计学意义（P<0.05）;乳腺癌MCF7细胞系敲减CENPT后P53、BAX、CASP3表达量均减少（P<0.05）。结论：与正常组织比较，在乳腺癌中CENPT表达水平降低，CDK1表达水平升高;P53表达水平与生存率成反比。乳腺癌中CENPT、P53、Bax、CASP3信号通路调节细胞凋亡参与乳腺癌的进展。

【关键词】 乳腺癌 生物信息学 CENPT CDK1

Effect and Expression of CENPT， CDK1 and P53 in Breast Cancer/ZHAO Ruohan， SHI Jiayi， LIU Xinjing， SONG Jie. //Medical Innovation of China， 2020， 17（09）： 0-031

[Abstract] Objective： To discuss the expression of CENPT， CDK1 and P53 in breast cancer， to explore the correlation and the regulatory relationship between gene expression and survival rate and pathological stage classification of breast cancer patients. Method： GEPIA database was used to analyze the expression and overall survival rate of breast cancer and normal samples， the pathological stage and gene expression in breast cancer patients， the correlation between CENPT and CDK1， BAX， BCL2， CASP3， P53， and the validation results of UALCAN database. RT-PCR was used to detect the expression of CDK1， BAX， BCL2， CASP3 and P53 in MCF7 cell lines after knocking down CENPT. Result： The expression of CDK1 and CENPT in breast cancer and normal tissues were significantly different （P<0.05）. The expression of CDK1 and BCL2 was significantly different from those of different pathological stages （P<0.05）. The different expression of P53 was significantly different in the overall survival rate of breast cancer patients （P<0.05）. The expression of P53， BAX and CASP3 in breast cancer MCF7 cell lines decreased after CENPT knockout （P<0.05）. Conclusion： Compared with normal tissues， the expression level of CENPT in breast cancer is lower and the expression level of CDK1 is higher， and the expression level of P53 is inversely proportional to the survival rate. CENPT， P53， Bax， CASP3 signaling pathway regulates apoptosis in breast cancer and participates in the progression of breast cancer.

[Key words] Breast cancer Bioinformatics CDK1 CENPT

First-authors address： Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.09.007

乳腺癌是女性最常見的恶性肿瘤之一，我国发病率为16.8%，且每年3%～4%递增[1]，文献[2]证实细胞周期调控分子参与肿瘤进程。Cyclin dependent kinase 1（CDK1）通过Centromere specafic proteins T（CENPT）调控动粒核心蛋白网络[3-4]。异常CDK1调控使细胞周期紊乱导致肿瘤发生[3]。磷酸化P53（tumor protein 53）诱导P21转录抑制CDK1活性。P53激活BCL2-Associated X（BAX）通路通过Caspase 3诱导凋亡[5]。CDK1、CENPT、P53与乳腺癌相关性未见报道，因此本文以三者为切入点探讨它们在乳腺癌中的作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂 乳腺癌MCF-7细胞系由哈尔滨工业大学癌生物学实验室惠赠，DMEM高糖培养基、胎牛血清、双抗、PBS、RNA提取试剂、Taq Mix、引物均购于生工生物有限公司，siRNA购自锐博生物有限公司。

1.2 在线数据库使用 GEPIA（gepia.cancer-pku.cn）进生物信息学处理。对乳腺癌和正常样本CENPT、CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3表达与患者病理分级、生存率及CENPT相关性数据进行分析，并用UALCAN（ualcan.path.uab.edul）验证。

1.3 细胞培养与siRNA转染 10% FBS的DMEM培养基培养MCF-7，Count star计数5次平均值。细胞80%时按说明书转染。

1.4 RT-PCR 检测基因的表达 试剂盒提取cDNA，扩增程序95 ℃ 5 min（95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s）×30次;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。凝胶电泳分析条带。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验。One-way ANOVA分析与乳腺癌患者病理分期相关性，Log-rank时序检验分析乳腺癌患者总体生存率。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌与正常样本中基因表达情况 GEPIA分析1 085例乳腺癌和291例正常样本log2（TPM+1）对数比差异见图1A。CENPT、CDK1差异均有统计学意义（P=0.000 031、0.000 004），CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3在乳腺癌中均高表达，CENPT与其他表达趋势相反。UALCAN趋势一致见图1B。

2.2 乳腺癌患者病理分期与表达分析 乳腺癌样本F分布>3，log2（TPM+1）对数假设检验P值单向病理阶段差异分析，Pr（>F）<0.05为显著，见图2。CDK1、BCL2表达对不同病理分期患者有统计学意义（F=5.17、3.2，P=0.000、0.012 6），BCL2表达随病理分期进展而降低，CDK1一期到二期上升。

2.3 乳腺癌患者总体生存率时序检验与表达分

析 GEPIA分析乳腺癌患者基因表达与生存率，Cox PH计算危险比见图3A、3B。同一时间低表达P53（HR=1.4，P=0.038）存活人数高于高表达，随着时间推进差异更明显。其他相关基因表达水平对乳腺癌患者的总体生存率影响均无统计学意义（P>0.05），与UALCAN趋势一致见图3C。P53高表达人群总体生存率危险比最高生存力最低，依次为CDK1、CASP3、BCL2、CENPT、BAX。

2.4 CENPT与CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3相关性分析 GEPIA分析基因表达相关性，PEARSON对数可视化，|R|=1相关性最强。CENPT与CASP3（P=5.2×10-54，R=-0.4）、CDK1（P=1.8×10-27，R=-0.29）、P53（P=8.5×10-21，

R=-0.25）相关性较强，与BCL2（P=3.7×10-13，R=-0.19）、

BAX（P=3.3×10-9，R=-0.16）较弱见图4A。半定量PCR分析，CENPT敲减前为（0.143±0.008），敲减后为（0.011±0.001），敲减前后比较差异有统计学意义（t=15.900，P=0.000）;MCF7中P53、CASP3、BAX分别由（0.053±0.003）、（0.068±0.004）、（0.043±0.002）减少至（0.009±0.001）、（0.028±0.002）、（0.022±0.001），差异均有统计学意义（t=14.099、9.373、7.623，P=0.000、0.002、0.002）;CDK1、BCL2表达变化比较，差异均无统计学意义（P>0.05）见图4B、C。

3 讨论

细胞增殖与细胞凋亡与肿瘤密切相关。遗传物质的不平衡是肿瘤进展的重要特征。染色体不稳定性产生主要涉及染色体的着丝粒、监测点等原因[6]。因此，着丝粒结构和功能的研究是探讨肿瘤细胞周期、细胞凋亡的切入点[7]。

本文分析探讨低表达CENPT与乳腺癌发生发展关系。数据库分析乳腺癌和正常样本CENPT、CDK1、BAX、BCL2、P53、CASP3表达，CENPT在

乳腺癌表达水平低于正常样本，与其他相反，其中CDK1最显著。CENPT与CASP3、CDK1、P53的相关性比BCL2、BAX强。P53对患者的总体生存率影响差异有统计学意義（P<0.05），成反比。敲低CENPT后P53、CASP3、BAL2表达量均减少（P<0.05），CDK1、BCL2差异均不显著（P>0.05）。CENPT调控CDK1周期动粒蛋白网络系统。虽然敲低CENPT后CDK1在转录水平变化不明显，但可能磷酸化的CDK1会引发细胞周期紊乱导致肿瘤的发生，同时P53可被CDK1-Cyclin复合物磷酸化诱导P21转录，P21抑制CDK1活性[8]，导致肿瘤发生。敲减CENPT后P53、BAX、CASP3表达量均减少，可能因为细胞凋亡是由基因控制细胞的主动自主有序死亡，涉及一系列基因的激活、表达及调控作用[9-10]。P53异常抑制抗凋亡因子BCL2，且BAX被P53转录激活导致P53成功诱导凋亡[11-12]。凋亡小体前提活化胱天蛋白酶家族CASP3参与凋亡执行、降解多种底物导致，E2F诱导BCL2促凋亡蛋白表达，P53突变功能丧失，凋亡小体活化，BAX突变失活BCL2表达失调[13-15]。CASP3能被P53及外界刺激细胞信号活化，释放BAX等促凋亡蛋白[16]，增强癌细胞控凋亡途径。

综上所述，乳腺癌中CENPT表达下调抑制P53，从而抑制BAX、CASP3凋亡通路参与乳腺癌进展。CENPT是否抑制P53下调P21、激活CDK1活性、调节细胞周期分子机制还需进一步研究。

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（收稿日期：2019-10-30） （本文编辑：程旭然）

*基金项目：黑龙江省省属高等学校基本科研业务费项目（2018-kyywfmy-0030）;牡丹江医学院研究生创新基金项目（2018YJSCX-33MY）