山楂红色素超声提取工艺的研究

于闰平，黄占波，陈佳奇，罗旭桐，孙隹靓，尚海巍

(辽宁科技学院 生物医药与化学工程学院，辽宁 本溪 117004)

山楂为蔷薇科山楂(Crataegus pinnatifida Bge.var.maj or N.E.Br.)或山里红(Crataegus pinnatifida Bge.)的成熟果实〔1〕。山楂是我国传统的药食同源植物，具有很高的营养价值和药用价值。山楂果皮中含有丰富的红色素，主要成分为矢车菊素糖苷等花青素类化合物〔2〕，具有强大的抗氧化活性和自由基清除能力，以及降血压、降血脂、防治动脉粥样硬化等多方面生理活性〔3〕，可以广泛用于药品、保健品和食品中。辽宁东部山区作为主产区分布有大量的山楂资源，但因为山楂鲜果的季节性强、不易储存及售价较低，野生山楂又因其个头小、果肉薄，在食品加工范畴内的利用受到限制，导致山楂种植林大面积抛荒、野生山楂无人问津，造成了山楂资源的严重浪费和巨大的经济损失，因此有必要对山楂进行产地精深加工和综合利用研究。基于新鲜山楂果皮中含有较多的花青素类山楂红色素，可作为很好的天然色素进行开发，能够用于食品、保健品等多方面，具有良好的应用前景。

目前，提取天然山楂红色素的研究报道较多，主要有超声-酶法〔4〕、超声提取〔5-7〕、微波萃取〔8,9〕、液泛提取〔10〕及浸渍提取等，研究对象多是山楂干品，而对产地深加工有益的新鲜山楂的研究少见。本研究采用pH示差法测定新鲜山楂提取物中花青素类红色素的含量，对影响鲜山楂红色素提取效果的主要因素进行了较为系统的研究，优化新鲜山楂中花青素类红色素的超声提取工艺条件，为辽宁地区山楂资源的精深加工和综合利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

仪器设备：T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；KQ-300VBD型三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；pHS6210型pH计(成都瑞驰分析控制仪器有限公司)；AR224CN电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。

材料：新鲜山楂，购自辽宁本溪市石桥子镇早市，果实直径约为1-2cm，果肉薄，颜色暗红，4℃储存。

试剂：盐酸、氯化钾、乙酸钠、乙酸、乙醇均为国产分析纯，购于国药集团沈阳化学试剂有限公司；实验用水为蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 山楂红色素的提取工艺

山楂鲜果，去核，打碎成果泥，取样，按一定料液比加入提取溶剂，超声提取，抽滤，滤液减压浓缩至少量，加水定容至10mL。

1.2.2 提取条件的考察

称取2g山楂，固定超声功率300W、以37%盐酸为酸化剂，按1.2.1项下方法，分别考察乙醇体积分数(0%、20%、40%、60%、80%、100%)、酸化剂加入量(溶剂总体积的0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25g/mL)、超声时间(10、20、30、40、50、60、70min)、超声温度(30、40、50、60、70℃)等因素对新鲜山楂花青素类红色素提取效果的影响。

1.2.3 提取次数的确定

称取3份山楂，在最佳工艺条件下分别提取1、2、3次，合并滤液，浓缩，定容，按1.2.4项下方法测定提取物中花青素类红色素的含量。

1.2.4 花青素含量的测定

以花青素的含量计，采用pH示差法〔11〕测定山楂提取物中红色素的得率。按1.2.1项下方法制备样品溶液。精密量取1.0mL，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液稀释至10mL，摇匀，平衡15min，以蒸馏水为空白，分别在波长510nm和700nm处测定吸光度，按下式计算花青素的含量。

花青素含量(mg/100g)=[(A×MW×DF×V)/(m×ε)]×100

式中：A=(A510nm-A700nm)pH1.0-(A510nm-A700nm)pH4.5

MW=449.2(矢车菊素葡萄糖苷分子量)；

DF=10(稀释倍数)；

ε=26900(摩尔消光系数，L/mol·cm)；

V=提取液体积(mL)；

m=称样量(g)。

2 结果与讨论

2.1 提取条件

2.1.1 乙醇体积分数对山楂红色素提取效果的影响

固定料液比1:20、超声时间20min，超声温度30℃，溶剂不加酸化剂，考察乙醇体积分数(0、20、40、60、80、100%)对山楂红色素得率的影响。

图1 乙醇浓度对花青素得率的影响

由图1可知，60%乙醇为提取溶剂时花青素得率最大，并随乙醇体积分数的增大呈先升后降的趋势。因为花青素为阳离子型黄酮，亲水性好，高浓度乙醇的溶解度低；低浓度乙醇会增加果胶等水溶性物质的溶涨，阻碍花青素的溶解和扩散；当乙醇浓度为60%时，既能保证对花青素较高的溶解能力，又可以减小水溶性杂质对花青素溶出的阻碍，故60%乙醇为溶剂时的提取效果最佳。

2.1.2 酸化剂加入量对山楂红色素提取效果的影响

固定乙醇体积分数60%、料液比1:20 g/mL、超声时间20min，超声温度30℃，考察酸化剂加入量(溶剂总体积0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的浓盐酸)对山楂红色素得率的影响。

图2 盐酸浓度对花青素得率的影响

由图2可知，加入0.1%盐酸做酸化剂时，花青素得率最高，pH计显示此时提取溶剂的pH约为2。花青素在酸性条件下成阳离子形态，水溶性好、稳定性高，所以少量酸化剂能够促进花青素溶出的同时能够增加其稳定性，而酸性较强时会导致花青素苷容易水解，因此不加酸化剂或加入酸化剂量多时花青素得率相对有所下降。综合考虑，选择加入0.1%的浓盐酸作为提取溶剂酸化剂。

2.1.3 料液比对山楂红色素提取效果的影响

固定酸化乙醇体积分数60%、超声时间20min，超声温度30℃，考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25g/mL)对山楂红色素得率的影响。

图3 料液比对花青素得率的影响

由图3可知，增加料液比可以提高花青素得率，料液比在1∶20 g/mL时得率最大，料液比继续增加花青素得率的变化不明显，说明此时山楂中花青素的溶出与再吸附基本达到平衡，故选择1∶20 g/mL的料液比为最佳条件。

2.1.4 超声时间对山楂花青素提取效果的影响

固定酸化乙醇体积分数60%、料液比1∶20g/mL、超声温度30℃，考察提取时间(10、20、30、40、50、60、70min)对山楂红色素得率的影响。

由图4可知，超声提取60min时花青素得率最高，超声时间在10～20min时花青素得率变化显著，而在20～60min区间花青素得率随时间增加变化不明显。其原因可能是因为提取初期浓度差较大，花青素得率增加趋势显著，20min后内外浓度差基本达到平衡，花青素得率变化不显著。另外，提取时间过长会导致溶液和物料温度过高从而破坏花青素的结构，反而会降低花青素得率。综合考虑，选择超声提取时间20min。

图4 提取时间对花青素得率的影响

2.1.5 超声温度对山楂花青素提取效果的影响

固定酸化乙醇体积分数60%、料液比1∶20 g/mL、超声时间20min，考察超声温度(30、40、50、60、70℃)对山楂红色素得率的影响。

由图5可知，提取温度在50℃以下时升温有利于花青素的溶出，当温度高于50℃后花青素得率随温度升高呈下降趋势，说明提取温度不宜超过50℃。其原因可能是50℃的提取温度会导致破坏花青素结构，导致其氧化或降解，又因为超声提取过程会通过其内部的空化作用自然放热升温，因此，选择室温为初始提取温度，同时控制提取过程溶剂温度以不超过50℃为宜。

图5 提取温度对花青素得率的影响

2.2 验证实验

按1.2.1项下方法和2.1项下最佳提取工艺条件制备供试品溶液，测定花青素的含量。结果，5份新鲜山楂样品中花青素得率分别为14.95、15.14、15.21、14.89、15.06mg/100g，平均得率为15.05mg/100g，RSD为0.8%，表明优化后山楂红色素的提取工艺可靠。

3 结论

影响新鲜山楂中花青素类红色素提取效果的主要因素包括提取溶剂种类、pH值、提取温度和提取时间等条件，此外，山楂鲜品与干品、果皮粉碎程度〔12〕等对山楂红色素的得率也有显著影响。本实验采用超声辅助法优化辽宁地区野生山楂鲜果中花青素类红色素的提取工艺条件，考察了乙醇体积分数、盐酸加入量、料液比、提取时间等影响因素，确定最佳提取工艺条件为乙醇体积分数60%，0.1%盐酸为酸化剂，料液比1:20 g/mL，提取时间20min，选择室温为初始提取温度，不超过50℃，此试验条件下新鲜山楂花青素类红色素的提取率为15.05mg/100g。本研究为辽宁地区山楂资源的精深加工和综合利用提供了合理的途径和可行的技术支持。