麝鼠TNFRSF13C和TNFRSF4基因表达分析

廖光珍 毕建鑫 张 钰 白素英

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040)

麝鼠(Ondatrazibethicus)，原产于北美洲，属哺乳纲(Mammalia)草食性动物，自20世纪初苏联引进后，被作为毛皮兽而大量饲养，于20世纪中叶传入中国进行人工养殖。成年雄性麝鼠在阴茎基部的腹部中线两侧的皮肤与肌肉之间，有一对能在繁殖期(分泌期)分泌粘稠的乳白色液体的香腺[1]。麝鼠香腺呈现明显的季节变化，在2月开始发育，3月开始进入分泌期，4月达到顶峰，然后继续变化直到8月，9月开始腺体萎缩，10月在阴茎基部附近缩小到黄豆大小，到了11月，结缔组织逐渐取代了腺体[2]。Zhang等[3-5]指出麝鼠香腺的这种季节性发育可能是受到激素与激素受体的调控，Li等[6]则指出钙和TGF-beta信号通路的基因在麝鼠香腺中的季节性差异表达可能与其萎缩有关，而有关肿瘤坏死因子在麝鼠香腺发育中的影响还未见研究。

由活化的巨噬细胞与单核细胞产生的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一种参与细胞免疫等多种生理调控过程的细胞因子[7-8]，其超家族成员(tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)能够结合一个或多个TNF受体超家族(TNFRSF)分子[9-10]，这些超家族成员的受体和配体是一种影响免疫系统发育、内稳态和适应性反应的信号传导因子[9]。其中，肿瘤坏死因子受体超家族成员13C(TNFRSF13C)，也称为BAFF受体，是含有单个细胞外富含半胱氨酸结构域(CRD)的Ⅲ型跨膜蛋白。有研究显示该受体通过与其衔接蛋白TRAF2和TRAF3的相互作用，诱导NF-κB和Bcl-2的抗凋亡信号通路的启动，导致抗凋亡蛋白的形成，从而促进细胞生存[11]。同为TNF受体超家族成员的TNFRSF4(TNF receptor superfamily member 4)也称OX40受体，在与衔接蛋白TRAF2和TRAF5结合后，同样能够促进NF-κB发挥效应[12-14]。本试验利用RT-qPCR技术比较麝鼠TNFRSF13C和TNFRSF4基因在繁殖期与非繁殖期的麝鼠心、肝、肺、肾、睾丸、肌肉和香腺中的转录水平差异，探讨TNFRSF13C和TNFRSF4基因在麝鼠繁殖与香腺发育中可能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

在5月初和10月末前往黑龙江省哈尔滨市的麝鼠养殖场，分别购买3只体况相近的1岁龄雄性麝鼠，适应性饲养2 d后采其心、肝、肺、肾、睾丸、肌肉与阴茎两侧的香腺，于液氮中速冻后放入冻存管中，并保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2 RNA提取与反转录

将试验组织放入盛有液氮的研钵中快速研磨后加入适量Trizol试剂(1 mL/100 mg组织)，然后利用RNA提取试剂盒(Thermo Scientific，USA)提取组织总RNA。利用DNase I去除总RNA中的DNA残留后，于纯化柱中洗脱RNA。然后利用1.3%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，按照全式金反转录试剂盒说明书进行反转录。

1.3 TNFRSF13C和TNFRSF4基因转录水平检测

利用NCBI设计引物，实验内参基因为β-肌动蛋白(β-actin)基因，引物序列见表1。RT-qPCR反应体系为20 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物(10 μmol/μL)各0.2 μL，2×SYBR GREEN I Supermix(ROCHE)10 μL，最后用 H2O补足。所有样品一式3份进行重复孔试验，扩增程序为：95 ℃10 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s 40个循环，退火时收集荧光信号。

1.4 数据处理

RT-qPCR扩增后，按△△Ct法计算结果。

内参基因均一化样本差异：△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因；2个时期样本表达差异：△△Ct=△Ct处理样品-△Ct对照样品；计算倍数变化=2-△△Ct。

两组间结果比较采用t检验，P≤0.01认为差异显著，P≤0.05认为差异有统计学意义。

表1 本文所用引物信息

Tab.1 Primers used in this study

2 结果与分析

经RT-qPCR检测后发现，肿瘤坏死因子TNFRSF13C和TNFRSF4基因在麝鼠心、肝、肺、肾、睾丸、香腺中繁殖期与非繁殖期的表达差异显著。其中TNFRSF13C基因在麝鼠心、肝、肺、肾、睾丸、香腺中繁殖期的转录水平约为非繁殖期的 2.4、8.2、10.6、2.8、9.6、4.8倍(图1)，差异显著(P<0.05)；TNFRSF4基因在麝鼠心、肝、肺、肾、睾丸、香腺中繁殖期的转录水平约为非繁殖期的2.2、3.6、4.2、2.3、1.9、4倍(图2)，差异显著(P≤0.05)；而TNFRSF13C和TNFRSF4基因在繁殖期与非繁殖期的麝鼠肌肉中的mRNA表达水平均没有明显差异(图2，图3)(P>0.5)。熔解曲线结果显示反应过程中未出现明显非特异性扩增(图3，图4)。

图1 繁殖期与非繁殖期麝鼠TNFRSF13C基因转录水平差异Fig.1 Difference of TNFRSF13C gene transcription level between reproductive and non-reproductive muskrat

3 讨论

通过RT-qPCR检测发现，麝鼠TNFRSF13C和TNFRSF4基因在其心、肝、肺、肾、睾丸、香腺中的转录水平均表现为繁殖期高于非繁殖期，并且差异显著(P≤0.05)，由此推测肿瘤坏死因子TNFRSF13C和TNFRSF4可能参与了麝鼠器官发育(香腺)和机体适应变化环境的过程。

图2 繁殖期与非繁殖期麝鼠TNFRSF4基因转录水平差异Fig.2 Difference of TNFRSF4 gene transcription level between reproductive and non-reproductive muskrat

图3 TNFRSF13C基因熔解曲线Fig.3 Melting curve of TNFRSF13C gene

图4 TNFRSF4基因熔解曲线Fig.4 Melting curve of TNFRSF4 gene

麝鼠是季节性繁殖动物，其香腺形态随着繁殖期和非繁殖期的更替而呈现出明显的季节变化——发育或萎缩。繁殖期的样品采集于5月，此时的麝鼠香腺发育成熟，香腺体积膨大并大量分泌麝鼠香。敲除小鼠的研究表明，TNFRSF4促进凋亡抑制因子BCL2、BCL2LL1/BCL2-XL的表达，从而抑制细胞凋亡[15]。TNFRSF13C是TNFSF13C(又称B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF，B 淋巴活化因子)的特异性受体。有研究显示BAFF/BAFF-R可通过诱导NF-κB和Bcl-2的表达激活抗凋亡信号通路[11]。并且，BAFF通过磷酸化PI3K路径可以促进凋亡蛋白Mcl-1表达，另外还促进生物代谢功能[16]。结合实验推测，在麝鼠香腺的发育中，肿瘤坏死因子TNFRSF13C和TNFRSF4表达的上调，促进了抗凋亡蛋白的生成，在促进香腺细胞的生存中起到了重要的调控作用，从而繁殖期的香腺呈现出快速发育，而非繁殖期呈现出快速萎缩的现象。在繁殖期麝鼠香腺中，肿瘤坏死因子TNFRSF13C的相对表达量高于TNFRSF4，说明在抗凋亡能力调控过程中，肿瘤坏死因子TNFRSF13C比TNFRSF4的调控作用可能更强。

已有研究证明，肿瘤坏死因子TNFRSF13C和TNFRSF4与淋巴细胞免疫有关。BAFF(TNFRSF13C)与 B 细胞存活、增殖、发育和成熟均有密切的关系。据认为该受体是BAFF介导的成熟B细胞存活所需的主要受体[11]。此外，BAFF 还发挥共刺激作用促进CD4+/CD2+T 淋巴细胞活化，同时调节细胞体液和细胞免疫应答[17-18]。而TNFRSF4(OX40受体)表达于活化的T淋巴细胞表面，参与T细胞的活化、增殖与迁移。OX40的共刺激分子OX40L则主要表达于活化的抗原呈递细胞表面，如树突状细胞、B淋巴细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞，以及某些组织细胞(心、肺、睾丸)[19]。它们所介导的共刺激信号在活化T细胞和促进B-T细胞相互作用过程中发挥重要的作用。敲除小鼠的研究表明该受体在CD4+T细胞应答中的作用，以及T细胞依赖性B细胞增殖和分化中的作用。与TNFRSF4相关的疾病包括免疫缺陷和急性移植物抗宿主病，其相关途径是免疫系统中的细胞因子信号转导和Th2分化途径[15]。麝鼠繁殖期时的心、肝、肺、睾丸中TNFRSF13C和TNFRSF4的转录水平高于非繁殖时期，并且差异具有统计学意义(P≤0.05)，说明麝鼠繁殖期的免疫能力强于非繁殖时期。这可能的原因是，10月末的麝鼠已经进入非繁殖期，该时期的哈尔滨天气严寒，麝鼠的食物匮乏，其获得的有限的能量被更多地用于保持体热，所以，免疫力相较食物充足的繁殖期有所下降，是机体适应大自然变化规律的表现。

综上所述，本研究通过TNFRSF13C和TNFRSF4基因的转录水平分析，揭示了这两个肿瘤坏死因子在麝鼠繁殖期和非繁殖期心、肝、肺、肾、睾丸和香腺中的表达差异，可能参与了麝鼠心、肝、肺、肾、睾丸和香腺发育，可以为麝鼠繁殖和提高泌香产量提供依据。