血管紧张素Ⅱ与血管平滑肌细胞中自噬水平的关系及机制研究

陈哲，于康英，周鸣鸣

血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统产生的生物活性肽［1］，作用于血管平滑肌，是调节心血管活动的一个重要活性物质，在心血管疾病如高血压、心肌肥厚、心脏衰竭的发生中有重要作用［2］。自噬是体内消化大分子蛋白的重要途径，当遇到营养缺乏等刺激时细胞通过形成自噬体消化体内的大分子物质，分解成氨基酸供机体使用，但是过度的自噬可能会过度消耗体内物质，造成细胞死亡，称为程序性死亡［3-5］，有文献报道在各类心血管疾病的发生过程中均有自噬水平的变化［6-8］，在心血管疾病的发生过程中，Ang Ⅱ和自噬水平的变化之间是否有内在的关系，Ang Ⅱ是否通过自噬水平的改变来调节心脏机能变化还鲜有报道，Ang Ⅱ下游的受体主要有AT1 受体和AT2 受体两种，而AT1 受体在Ang Ⅱ发挥的大部分功能中起到介导作用［9］，若Ang Ⅱ能够诱导细胞发生自噬，那么是不是通过Ang Ⅱ的主要受体AT1 受体来发挥作用呢，本研究自2017年3月至2018年3月以体外培养的血管平滑肌细胞（VSMC）为实验材料，设计了以下一系列实验来探讨这几个问题。

1 材料与方法

1.1 原代细胞培养 采用组织贴块法原代培养血管平滑肌细胞。取150 g 左右的雄性SD 大鼠，断头法处死，无菌条件下迅速剥离腹主动脉，去除外膜和内皮层，切成1 mm3的小块贴在培养皿瓶底上，培养皿中加入10 mL含20%胎牛血清，1%青链霉素的DMEM 培养基后，置于37 ℃，含5%CO2的细胞培养箱中培养，待单层细胞覆盖培养皿瓶底80%以上后去除组织块，用0.25%胰酶传代，取传代在5～10 次以内的血管平滑肌细胞备用。

1.2 Ang Ⅱ作用后蛋白质免疫印迹测定 取培养皿中培养的血管平滑肌细胞以1×106/mm2传代到六孔板中，将六孔板中生长面积达70%～80%的血管平滑肌细胞饥饿12 h 后，加入Ang Ⅱ等药物，作用24 h 后，取细胞标本做蛋白质免疫印迹。在4 ℃条件下，用细胞裂解液收集贴壁细胞，12 000 r/min离心10 min，取上清蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转膜60 min，所用抗体为脂化和膜相关蛋白3B（LC3B）（Abcam公司）。

1.3 免疫荧光观察 取培养皿中培养的血管平滑肌细胞以1×105个/平方毫米传代到24孔板中，将24孔板中生长面积达70%～80%的血管平滑肌细胞饥饿12 h后，加入Ang Ⅱ等药物，作用24 h后，取细胞标本做免疫荧光。用1∶1甲醇∶丙酮固定，用Triton-x100透化，所用抗体为LC3B（Abcam公司），Anti-actin antibody（密理博公司）。

1.4 方法 以VSMC 为研究对象，设立组别分别为空白组、Ang Ⅱ组、自噬抑制剂（3-MA）组、自噬促进剂雷帕霉素（Rap）组、AT1 受体抑制剂（ARB）组、3-MA+Ang Ⅱ组、Rap+Ang Ⅱ组、ARB+Ang Ⅱ组，采用四唑盐（MTT）比色法检测细胞存活率，蛋白质免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3 Ⅱ表达的变化，免疫荧光法检测自噬小体数目的变化。

1.5 统计学方法 用Sigma Pro5.0软件分析蛋白质免疫印迹图像结果，用SPSS 18.0 软件进行数据统计，组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang Ⅱ对细胞生存和活力的影响 对96孔板中生长面积70%～80%的血管平滑肌细胞用Ang Ⅱ作用24 h 后做MTT 实验，测定吸光度（吸光度和细胞生存活力成正相关），结果空白组吸光度为（0.159±0.001），Ang Ⅱ组吸光度为（0.151±0.003），P＞0.05，差异无统计学意义，可见Ang Ⅱ作用24 h后细胞生存活力变化不明显，影响不大，说明AngⅡ作用这些时间后没有造成细胞生存率的变化，即没有造成细胞死亡。

2.2 Ang Ⅱ促进血管平滑肌细胞的LC3-Ⅱ表达量增多且呈时间依赖性和浓度依赖性 对六孔板中生长面积达到70%～80%的血管平滑肌细胞用10-7mol/L Ang Ⅱ作用0、6、12、24、48、72 h后蛋白质免疫印迹检测LC-3Ⅱ［10-12］表达量的变化，结果如图1，将0 h 组灰度值定为1，则6，12，24，48，72 h 组分别为0.91，1.23，2.35，1.85，1.51。随着时间延长，LC-3Ⅱ表达量增多，24 h达到最大，说明Ang Ⅱ诱导血管平滑肌细胞LC-3Ⅱ表达量增多，且呈现一定的时间依赖性。另外，对六孔板中生长面积达到70%～80%的血管平滑肌细胞用10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L Ang Ⅱ作用24 h 后蛋白质免疫印迹检测LC-3Ⅱ表达量的变化，结果如图2，将浓度为0 组灰度值定为1，则10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 浓度组分别为1.81，2.81，3.32，3.15，3.92。随着浓度递减，LC-3Ⅱ表达量增多，说明Ang Ⅱ诱导血管平滑肌细胞LC-3Ⅱ表达量增多，且呈现一定的浓度依赖性。

图1 Ang Ⅱ促进血管平滑肌细胞的LC3-Ⅱ表达量增多且呈时间依赖性：A为蛋白质免疫印迹图像，B为统计直方图

同时自噬抑制剂3-MA 和自噬促进剂Rap［13］的实验佐证了这一结果，设立组别为空白组、Ang Ⅱ、3-MA、3-MA+Ang Ⅱ组，及空白组、Ang Ⅱ、Rap、Rap+Ang Ⅱ组，Ang Ⅱ浓度采用10-7mol/L，作用时间为24 h 后，检测LC-3Ⅱ表达水平的变化，结果如图3。将空白组灰度值定为1，则Ang Ⅱ组，3-MA组，3-MA+Ang Ⅱ组分别为2.52，0.71，0.82。将空白组灰度值定为1，则Ang Ⅱ组，Rap组，Rap+Ang Ⅱ组分别为1.89，1.54，2.48。可见3-MA+Ang Ⅱ组比Ang Ⅱ组的LC-3Ⅱ表达量少，即3-MA对Ang Ⅱ（作用浓度和时间为10-7mol/L，24 h）引起的LC-3Ⅱ表达量增多起到抑制作用，也就是说Ang Ⅱ能够诱导血管平滑肌细胞自噬的发生，且可被自噬抑制剂抑制。Rap+Ang Ⅱ组比Ang Ⅱ组的LC-3Ⅱ表达量多，可见Rap对Ang Ⅱ（作用浓度和时间为10-7mol/L，24 h）引起的LC-3Ⅱ表达量增多起到叠加作用，也就是说Ang Ⅱ能够诱导血管平滑肌细胞自噬的发生，且可被自噬抑制剂抑制，被自噬促进剂叠加作用，且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。

图2 Ang Ⅱ促进血管平滑肌细胞的LC3-Ⅱ表达量增多且呈浓度依赖性：A为蛋白质免疫印迹图像，B为统计直方图

2.3 免疫荧光显示自噬小体的变化 多种检测方法共同使用能够确保实验的准确性，为此，采用另外一种实验方法免疫荧光来检测自噬发生的水平已验证是否和蛋白质免疫印迹的结果一致。取培养皿中培养的血管平滑肌细胞以1×105个/mm2传代到24 孔板中，将24 孔板中生长面积达70%～80%的血管平滑肌细胞饥饿12 h 后，加入Ang Ⅱ等药物（设立组别空白组，Ang Ⅱ，3-MA+Ang Ⅱ，Rap+AngⅡ组），作用24 h 后，取细胞标本做免疫荧光，用抗体LC3（Abcam 公司），Anti-actin antibody（密理博公司）检测自噬小体［10］，自噬小体的数目和自噬水平呈正相关。如图4，可见Ang Ⅱ能促进自噬小体数目的增多，3-MA 能对Ang Ⅱ的影响起到抑制作用，Rap 能对Ang Ⅱ的影响起到叠加作用，验证了蛋白质免疫印迹的结果。

图3 Ang Ⅱ诱导血管平滑肌细胞自噬的发生，且被自噬抑制剂抑制，被自噬促进剂叠加：A为蛋白质免疫印迹图像，B为统计直方图

图4 自噬抑制剂（3-MA）和雷帕霉素（Rap）对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）引起的自噬小体数目变化的影响：A为空白组，B为Ang Ⅱ，C为3-MA+Ang Ⅱ，D为Rap+Ang Ⅱ

2.4 Ang Ⅱ通过AT1 受体诱导LC-3Ⅱ表达量增多 那么Ang Ⅱ是通过什么诱导了自噬的发生呢？我们知道它下游的主要受体是AT1 受体［14-16］，那么这个自噬的发生是否也是通过AT1受体，通过设计以下实验进行研究。设立组别为空白组、Ang Ⅱ、ARB、ARB+Ang Ⅱ组，Ang Ⅱ浓度采用10-7mol/L，作用时间为24 h 后，检测自噬程度的变化，结果如图5，将空白组灰度值定为1，则Ang Ⅱ组，ARB 组，ARB+Ang Ⅱ组分别为3.25，0.82，0.62。可见ARB+Ang Ⅱ组比Ang Ⅱ组的LC-3Ⅱ表达量少，即ARB对Ang Ⅱ（作用浓度和时间为10-7mol/L，24 h）引起的LC-3Ⅱ表达量增多起到抑制作用，即抑制了AT1受体也抑制了Ang Ⅱ诱导的自噬，说明Ang Ⅱ通过AT1受体诱导自噬发生。

图5 Ang Ⅱ通过AT1受体诱导LC-3Ⅱ表达量增多：A为蛋白质免疫印迹图像，B为统计直方图

同时通过免疫荧光实验来验证这一结果，取培养皿中培养的血管平滑肌细胞以1×105/mm2传代到24 孔板中，将24 孔板中生长面积达70%～80%的血管平滑肌细胞饥饿12 h 后，加入Ang Ⅱ等药物（设立组别空白组，Ang Ⅱ，ARB+Ang Ⅱ组），作用24 h后，取细胞标本做免疫荧光，用抗体LC3 Ⅱ（Abcam公司），Anti-actin antibody（密理博公司）检测自噬小体［10］。如图6。可见Ang Ⅱ能促进自噬小体数目的增多，ARB 能对Ang Ⅱ的影响起到抑制作用，说明Ang Ⅱ通过AT1 受体诱导自噬发生，验证了蛋白质免疫印迹的实验结果。

图6 血管紧张素Ⅱ受体抑制剂（ARB）对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）引起的自噬小体数目变化的影响：A为空白组，B为Ang Ⅱ，C为Rap+Ang Ⅱ

3 讨论

这样我们得出结论Ang Ⅱ能促进血管平滑肌细胞发生自噬，且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。抑制AT1受体能够抑制Ang Ⅱ诱导的VSMC的自噬，说明这种影响是通过AT1 受体发挥作用的。由此可以猜想Ang Ⅱ是通过AT1 受体影响了下游信号通路，最终促进了自噬的发生，即Ang Ⅱ通过AT1受体诱导血管平滑肌细胞发生自噬。

之前已有人证实Ang Ⅱ能够促进肾脏足细胞和内皮细胞自噬的发生［17-18］，我们的研究证实AngⅡ在血管平滑肌细胞中也能够诱导自噬的发生，通过检测自噬相关蛋白LC3 Ⅱ和自噬小体两种方法证实Ang诱导VSMC自噬的发生并且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。在Ang Ⅱ作用浓度为10-7mol/L，作用时间为24 h 时，达到最佳诱导效果。对于自噬在心血管疾病中的发生机制，有文献报道Ang Ⅱ促进线粒体ROS 的增多伴随着自噬的增强［18］，而研究报道，Ang Ⅱ通过AT1 受体进而激活NADPH氧化酶最终导致ROS的增多［19-20］，我们的研究证实了Ang Ⅱ是通过AT1 受体而导致自噬的发生，暗示Ang Ⅱ、AT1 受体、ROS 和自噬发生之间可能存在一个信号通路，这个信号通路的阐明将有助于我们进一步了解自噬的发生及调控机制。

这项研究提供了Ang Ⅱ能够诱导自噬发生的依据，并且阐明了其中的可能机制。自噬是一把双刃剑，适度自噬能够清除体内垃圾，过度自噬可能造成机体损伤［21］，已有报道证明Ang Ⅱ能够诱导平滑肌细胞钙化［22］，及动脉粥样硬化［23-25］，如果能够将Ang Ⅱ诱导的自噬同平滑肌细胞钙化及动脉粥样硬化联系起来，将自噬作为调节治疗平滑肌细胞钙化及动脉粥样硬化的靶点，将具有更为重要的意义。