高效液相色谱-串联质谱法同时测定五味子糖浆中7 种木脂素的含量

吴子静，梁大虎，杨斌，谢海棠

作为著名的中药，五味子始载于《神农本草经》，列为上品，具有滋阴养气作用［1-2］。《新修本草》中记载五味子果肉和果皮酸甜，而种子苦辣，一起食用，有咸、甜、酸、辛辣和苦味，所以五味子又被称为“五味果”或“五味子”［3］。五味子是中国处方中常见成分，现收录于2015 年版《中国药典》第一部，并以五味子醇甲作为其质量标准［4］。现代药理研究表明，五味子含有木脂素［5］、挥发油［6］、有机酸［7］、维生素［8］、萜类［9］、多糖［10］等化学成分，但其大部分生物和药理作用可归因于其木脂素成分，含量高达8%，特别是二苯并环辛二烯型木脂素，可降低血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶（SGPT）水平，抑制血小板聚集，显示出抗氧化，钙拮抗，抗肿瘤和抗人类免疫缺陷病毒（HIV）等作用［11-12］。

五味子糖浆由五味子单味药材组成，用于肾精不足，气血亏虚引起的神经衰弱、头晕、失眠［13］。目前，关于五味子糖浆中木脂素的含量测定已有文献报道，但只对其中一种或两种木脂素成分含量进行了测定，难以全面反映五味子糖浆中木脂素的质量［14-16］，且文献均采用高效液相色谱（HPLC）法，采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法同时测定五味子糖浆中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲这7种木脂素的分析方法尚未见报道。本实验自2018年1月至2019年1月采用HPLC-MS/MS法同时测定五味子糖浆中7 种木脂素成分的含量，该方法简便、快捷、可靠，为有效控制五味子糖浆产品质量提供了方法。

1 仪器与试药

API 3200质谱仪，Analyst 1.6.2质谱数据处理软件（美国应用生物系统公司），Shimadzu LC-20AD二元泵，SIL-HTc 自动进样器，CTO-10ASvp 柱温箱（日本岛津公司）；IKA-Werke Typ VX 2E型摇床（德国仪科公司）；METTLER TOLEDO ME55 微量分析天平；Millipore Direct-Q3 型纯水仪（美国密理博公司）；高速离心机［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］。

五味子醇甲（批号：110857-201211，含量：99.9%）、五味子甲素（批号：110764-201111，含量：99.3%）购于中国食品药品检定研究院；五味子醇乙（批号：P28S6F3984，含量：98%）、五味子乙素（批号：P29J8F38066，含量：98%）、五味子丙素（批号：P28J8F36916，含量：98%）、五味子酚（批号：P13O8F45574，含量：98%）、五味子酯甲（批号：P13O8S45575，含量：98%）均购于上海源叶生物科技有限公司；内标联苯双酯（批号：C10105842，含量：98%），购于上海麦克林生化科技有限公司；五味子糖浆均为药店销售的产品［上海海虹实业（集团）巢湖今辰药业有限公司，批号：170511，180203，180510］。乙酸铵分析纯（上海四试赫维化工有限公司）；甲醇、甲酸为色谱纯（德国默克公司）；水为去离子超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5µm）色谱柱，流动相：90%甲醇（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸，5 mmol/L乙酸铵），等度洗脱，流速为0.5 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10µL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾电离源（ESI），正离子扫描，多反应离子监测模式（MRM）进行定量分析。7种木脂素成分的质谱参数见表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲对照品适量，用甲醇配制成浓度分别为1.22、0.45、1.16、0.58、0.51、0.54、0.53 g/L的单一对照品储备液；分别精密量取各对照品储备液适量置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，分别得到五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲质量浓度为40.00、9.02、5.00、11.64、5.13、5.40、5.26 mg/L 的混合对照品储备液；所有溶液均4 ℃保存。

2.2.2 内标溶液的配制 精密称取联苯双酯对照品适量，用甲醇溶解配制成浓度为0.73 g/L 的内标储备液。使用时，用甲醇进一步稀释成浓度为500µg/L，作为内标溶液，4 ℃保存。

2.2.3 供试品溶液的配制 精密吸取五味子糖浆100µL，置10 mL 离心管中，用50%甲醇水稀释100倍，超声提取15 min，0.45µm 微孔滤膜连续过滤两次，12 000 r/mim离心5 min，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各10µL，按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定。在此色谱条件下五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲和联苯双酯的出峰时间分别为3.94、4.38、6.30、8.17、9.78、5.16、4.75、3.46 min。空白溶剂、对照品及五味子糖浆供试品溶液的色谱图见图1。

2.3.2 线性关系考察及定量下限测定 甲醇稀释上述混合对照品储备液，得到系列混合对照品的工作液。其中五味子醇甲的线性浓度为125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00 和4 000.00µg/L，五味子醇乙的线性浓度为28.18、56.35、112.70、225.40、450.80和901.60µg/L，五味子甲素的线性浓度 为15.63、31.25、62.50、125.00、250.00 和500.00µg/L，五味子乙素的线性浓度为36.38、72.76、145.53、291.05、582.10和1 164.20µg/L，五味子丙素的线性浓度为16.02、32.03、64.06、128.13、256.25 和512.50 µg/L，五味子酚的线性浓度为16.02、32.03、64.06、128.13、256.25 和512.50µg/L，五味子酯甲的线性浓度为16.45、32.89、65.78、131.57、263.13 和526.26µg/L，所有溶液均按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定，记录各分析物的峰面积AS和内标联苯双酯的峰面积AIS，以AS与AIS的比值F为纵坐标，浓度X为横坐标，作加权线性回归计算（权重系数为1/X2），五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲的回归方程、回归系数等参数见表2。这7种木脂素的定量 限（LOQ）分 别 为125.00、28.18、15.63、36.38、16.02、16.88和16.45µg/L，信噪比S/N均大于10。

表1 7种木脂素成分的质谱分析参数

图1 空白溶剂、对照品及五味子糖浆供试品色谱图：A为空白溶剂；B为对照品；C为供试品

表2 7种木脂素成分线性范围、回归方程、检测限和定量限

2.3.3 精密度试验 按“2.1”项下HPLC-MS/MS 条件对同一混合对照品溶液（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲浓度分别为：1 000.00、225.40、125.00、291.05、128.13、135.00和131.57µg/L）重复进样6次，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲的相对标准偏差（RSD，n＝6）分别为2.17%、2.01%、1.68%、1.47%、0.97%、1.19%和1.30%，说明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批五味子糖浆样品6份（批号170511），按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定。测得五味子糖浆中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲含量平均值分别为175.22、33.47、29.42、90.21、11.01、2.93、3.65 mg/L，相对标准偏差（RSD，n＝6）分别为2.10%、1.58%、2.26%、1.34%、1.74%、1.67%、2.32%，表明重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号170511），分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定。测得五味子糖浆中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲的相对标准偏差（RSD，n＝8）分别为1.61%、2.06%、1.44%、1.53%、2.10%、1.62%、0.97%，结果表明，供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取9份已知7种木脂素含量的五味子糖浆（批号170511），按7种木脂素含量的80%、100%、120%添加混合对照品溶液后按“2.2.3”项下制备供试品溶液，每种比例各配制3份，按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定，结果见表3。

2.4 样品含量测定 精密量取3个批号的五味子糖浆（批号170511、180203，180510）各6份，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定，各批号五味子糖浆中7种待测物含量结果见表4。

表3 回收率试验结果

表4 7种木脂素成分含有量测定结果/（mg/L，n＝6）

3 讨论

3.1 色谱质谱条件的确定

3.1.1 色谱条件的确定 参考国内外文献并结合待测物的物理化学性质，考察了3种色谱柱Agilent Zorbax SB-C18（50 mm×3.0 mm，3.5µm）［17］、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5µm）［18］和Waters ACQUITY HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8µm）［19］，以比较色谱峰峰形、分离度；对于流动相的选择，首先考察了乙腈-水和甲醇-水两种体系，结果表明与乙腈-水体系相比甲醇-水体系分离度更好，然后考察甲醇-水体系下加入甲酸、乙酸铵等酸的影响；同时还考察了流速、柱温和不同进样量，结果表明当流速为0.5 mL/min、柱温30 ℃、进样量为10µL时，五味子中7种待测物的色谱峰峰形较好，可以与周围干扰物质达到良好的基线分离。所以最后确定采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5µm）色谱柱，90%甲醇（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸，5 mmol乙酸铵）系统，流速为0.5 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10µL。7种木脂素在此色谱条件下的出峰时间分别为3.94、4.38、6.30、8.17、9.78、5.16、4.75 min。

3.1.2 质谱条件的确定 本实验分别将各待测分析物及内标配制成5 mg/L的溶液，用于注射泵连续进样，以优化质谱参数。采用电喷雾电离源（ESI），多反应离子监测模式（MRM）进行定量分析，并比较了正离子和负离子模式下离子峰强度，结果表明正离子条件下离子峰更稳定、强度最好。在正离子模式下，根据先前选定的母离子、子离子，组成离子对，做MRM扫描，分别优化DP、EP、CE、CXP等参数。

3.2 小结 五味子在我国已有几千年的历史，《神农本草经》将五味子列为上品。近年来五味子及含有五味子的复方制剂应用越来越广泛，但查阅五味子糖浆中木脂素含量测定的相关文献，发现只对其中一种或两种木脂素成分含量进行了测定，难以全面反映五味子糖浆中木脂素的质量。本研究采用HPLC-MS/MS同时测定五味子糖浆中7种木脂素成分的含量。

2015年版《中国药典》第一部五味子糖浆“含量测定”项下规定，每l mL 五味子糖浆含五味子以五味子醇甲（C24H32O7）计，不得少于0.12 mg。由含量测定结果可以看出3 批五味子糖浆（批号：170511、180203、180510）中五味子醇甲的含量均符合药典标准。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲在一定范围内线性关系良好（r＞0.995），加样回收率在92.41%～100.94%之间，该HPLC-MS/MS 方法可在11 min内快速分离检测出五味子糖浆中的7种木脂素成分，方法简单、灵敏、准确，可为五味子糖浆的全面质量控制提供科学依据。