高效液相色谱-串联质谱法同时测定五味子糖浆中7 种木脂素的含量

2020-04-30 06:01吴子静梁大虎杨斌谢海棠
安徽医药 2020年5期
关键词:五味子糖浆批号

吴子静,梁大虎,杨斌,谢海棠

作为著名的中药,五味子始载于《神农本草经》,列为上品,具有滋阴养气作用[1-2]。《新修本草》中记载五味子果肉和果皮酸甜,而种子苦辣,一起食用,有咸、甜、酸、辛辣和苦味,所以五味子又被称为“五味果”或“五味子”[3]。五味子是中国处方中常见成分,现收录于2015 年版《中国药典》第一部,并以五味子醇甲作为其质量标准[4]。现代药理研究表明,五味子含有木脂素[5]、挥发油[6]、有机酸[7]、维生素[8]、萜类[9]、多糖[10]等化学成分,但其大部分生物和药理作用可归因于其木脂素成分,含量高达8%,特别是二苯并环辛二烯型木脂素,可降低血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶(SGPT)水平,抑制血小板聚集,显示出抗氧化,钙拮抗,抗肿瘤和抗人类免疫缺陷病毒(HIV)等作用[11-12]。

五味子糖浆由五味子单味药材组成,用于肾精不足,气血亏虚引起的神经衰弱、头晕、失眠[13]。目前,关于五味子糖浆中木脂素的含量测定已有文献报道,但只对其中一种或两种木脂素成分含量进行了测定,难以全面反映五味子糖浆中木脂素的质量[14-16],且文献均采用高效液相色谱(HPLC)法,采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法同时测定五味子糖浆中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲这7种木脂素的分析方法尚未见报道。本实验自2018年1月至2019年1月采用HPLC-MS/MS法同时测定五味子糖浆中7 种木脂素成分的含量,该方法简便、快捷、可靠,为有效控制五味子糖浆产品质量提供了方法。

1 仪器与试药

API 3200质谱仪,Analyst 1.6.2质谱数据处理软件(美国应用生物系统公司),Shimadzu LC-20AD二元泵,SIL-HTc 自动进样器,CTO-10ASvp 柱温箱(日本岛津公司);IKA-Werke Typ VX 2E型摇床(德国仪科公司);METTLER TOLEDO ME55 微量分析天平;Millipore Direct-Q3 型纯水仪(美国密理博公司);高速离心机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。

五味子醇甲(批号:110857-201211,含量:99.9%)、五味子甲素(批号:110764-201111,含量:99.3%)购于中国食品药品检定研究院;五味子醇乙(批号:P28S6F3984,含量:98%)、五味子乙素(批号:P29J8F38066,含量:98%)、五味子丙素(批号:P28J8F36916,含量:98%)、五味子酚(批号:P13O8F45574,含量:98%)、五味子酯甲(批号:P13O8S45575,含量:98%)均购于上海源叶生物科技有限公司;内标联苯双酯(批号:C10105842,含量:98%),购于上海麦克林生化科技有限公司;五味子糖浆均为药店销售的产品[上海海虹实业(集团)巢湖今辰药业有限公司,批号:170511,180203,180510]。乙酸铵分析纯(上海四试赫维化工有限公司);甲醇、甲酸为色谱纯(德国默克公司);水为去离子超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5µm)色谱柱,流动相:90%甲醇(含0.1%甲酸)-水(含0.1%甲酸,5 mmol/L乙酸铵),等度洗脱,流速为0.5 mL/min,柱温:30 ℃,进样量:10µL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾电离源(ESI),正离子扫描,多反应离子监测模式(MRM)进行定量分析。7种木脂素成分的质谱参数见表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲对照品适量,用甲醇配制成浓度分别为1.22、0.45、1.16、0.58、0.51、0.54、0.53 g/L的单一对照品储备液;分别精密量取各对照品储备液适量置10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,分别得到五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲质量浓度为40.00、9.02、5.00、11.64、5.13、5.40、5.26 mg/L 的混合对照品储备液;所有溶液均4 ℃保存。

2.2.2 内标溶液的配制 精密称取联苯双酯对照品适量,用甲醇溶解配制成浓度为0.73 g/L 的内标储备液。使用时,用甲醇进一步稀释成浓度为500µg/L,作为内标溶液,4 ℃保存。

2.2.3 供试品溶液的配制 精密吸取五味子糖浆100µL,置10 mL 离心管中,用50%甲醇水稀释100倍,超声提取15 min,0.45µm 微孔滤膜连续过滤两次,12 000 r/mim离心5 min,取续滤液,即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各10µL,按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定。在此色谱条件下五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲和联苯双酯的出峰时间分别为3.94、4.38、6.30、8.17、9.78、5.16、4.75、3.46 min。空白溶剂、对照品及五味子糖浆供试品溶液的色谱图见图1。

2.3.2 线性关系考察及定量下限测定 甲醇稀释上述混合对照品储备液,得到系列混合对照品的工作液。其中五味子醇甲的线性浓度为125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00 和4 000.00µg/L,五味子醇乙的线性浓度为28.18、56.35、112.70、225.40、450.80和901.60µg/L,五味子甲素的线性浓度 为15.63、31.25、62.50、125.00、250.00 和500.00µg/L,五味子乙素的线性浓度为36.38、72.76、145.53、291.05、582.10和1 164.20µg/L,五味子丙素的线性浓度为16.02、32.03、64.06、128.13、256.25 和512.50 µg/L,五味子酚的线性浓度为16.02、32.03、64.06、128.13、256.25 和512.50µg/L,五味子酯甲的线性浓度为16.45、32.89、65.78、131.57、263.13 和526.26µg/L,所有溶液均按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定,记录各分析物的峰面积AS和内标联苯双酯的峰面积AIS,以AS与AIS的比值F为纵坐标,浓度X为横坐标,作加权线性回归计算(权重系数为1/X2),五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲的回归方程、回归系数等参数见表2。这7种木脂素的定量 限(LOQ)分 别 为125.00、28.18、15.63、36.38、16.02、16.88和16.45µg/L,信噪比S/N均大于10。

表1 7种木脂素成分的质谱分析参数

图1 空白溶剂、对照品及五味子糖浆供试品色谱图:A为空白溶剂;B为对照品;C为供试品

表2 7种木脂素成分线性范围、回归方程、检测限和定量限

2.3.3 精密度试验 按“2.1”项下HPLC-MS/MS 条件对同一混合对照品溶液(五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲浓度分别为:1 000.00、225.40、125.00、291.05、128.13、135.00和131.57µg/L)重复进样6次,五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲的相对标准偏差(RSD,n=6)分别为2.17%、2.01%、1.68%、1.47%、0.97%、1.19%和1.30%,说明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批五味子糖浆样品6份(批号170511),按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定。测得五味子糖浆中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲含量平均值分别为175.22、33.47、29.42、90.21、11.01、2.93、3.65 mg/L,相对标准偏差(RSD,n=6)分别为2.10%、1.58%、2.26%、1.34%、1.74%、1.67%、2.32%,表明重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号170511),分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定。测得五味子糖浆中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲的相对标准偏差(RSD,n=8)分别为1.61%、2.06%、1.44%、1.53%、2.10%、1.62%、0.97%,结果表明,供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取9份已知7种木脂素含量的五味子糖浆(批号170511),按7种木脂素含量的80%、100%、120%添加混合对照品溶液后按“2.2.3”项下制备供试品溶液,每种比例各配制3份,按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定,结果见表3。

2.4 样品含量测定 精密量取3个批号的五味子糖浆(批号170511、180203,180510)各6份,按“2.2.3”项下制备供试品溶液,按“2.1”项下HPLC-MS/MS条件进行测定,各批号五味子糖浆中7种待测物含量结果见表4。

表3 回收率试验结果

表4 7种木脂素成分含有量测定结果/(mg/L,n=6)

3 讨论

3.1 色谱质谱条件的确定

3.1.1 色谱条件的确定 参考国内外文献并结合待测物的物理化学性质,考察了3种色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(50 mm×3.0 mm,3.5µm)[17]、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5µm)[18]和Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8µm)[19],以比较色谱峰峰形、分离度;对于流动相的选择,首先考察了乙腈-水和甲醇-水两种体系,结果表明与乙腈-水体系相比甲醇-水体系分离度更好,然后考察甲醇-水体系下加入甲酸、乙酸铵等酸的影响;同时还考察了流速、柱温和不同进样量,结果表明当流速为0.5 mL/min、柱温30 ℃、进样量为10µL时,五味子中7种待测物的色谱峰峰形较好,可以与周围干扰物质达到良好的基线分离。所以最后确定采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5µm)色谱柱,90%甲醇(含0.1%甲酸)-水(含0.1%甲酸,5 mmol乙酸铵)系统,流速为0.5 mL/min,柱温:30 ℃,进样量:10µL。7种木脂素在此色谱条件下的出峰时间分别为3.94、4.38、6.30、8.17、9.78、5.16、4.75 min。

3.1.2 质谱条件的确定 本实验分别将各待测分析物及内标配制成5 mg/L的溶液,用于注射泵连续进样,以优化质谱参数。采用电喷雾电离源(ESI),多反应离子监测模式(MRM)进行定量分析,并比较了正离子和负离子模式下离子峰强度,结果表明正离子条件下离子峰更稳定、强度最好。在正离子模式下,根据先前选定的母离子、子离子,组成离子对,做MRM扫描,分别优化DP、EP、CE、CXP等参数。

3.2 小结 五味子在我国已有几千年的历史,《神农本草经》将五味子列为上品。近年来五味子及含有五味子的复方制剂应用越来越广泛,但查阅五味子糖浆中木脂素含量测定的相关文献,发现只对其中一种或两种木脂素成分含量进行了测定,难以全面反映五味子糖浆中木脂素的质量。本研究采用HPLC-MS/MS同时测定五味子糖浆中7种木脂素成分的含量。

2015年版《中国药典》第一部五味子糖浆“含量测定”项下规定,每l mL 五味子糖浆含五味子以五味子醇甲(C24H32O7)计,不得少于0.12 mg。由含量测定结果可以看出3 批五味子糖浆(批号:170511、180203、180510)中五味子醇甲的含量均符合药典标准。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲在一定范围内线性关系良好(r>0.995),加样回收率在92.41%~100.94%之间,该HPLC-MS/MS 方法可在11 min内快速分离检测出五味子糖浆中的7种木脂素成分,方法简单、灵敏、准确,可为五味子糖浆的全面质量控制提供科学依据。

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