猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型、奇异变形杆菌混合感染病例的病原学诊断

陈 静， 杨 鹏， 尹德晶， 谢晓东， 李乔斌， 岳 筠， 程振涛*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

近年来，随着生猪养殖模式的多样化及频繁引种，猪场疫病越来越复杂，猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病等疫病已成为危害养猪业的重要疫病，并常有混合感染[1]。其中猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病是免疫抑制性疫病，感染后可导致机体免疫力严重下降，极易与其他病原体混合或继发感染，从而导致临床症状复杂化，并造成严重损失和危害[2～4]。2019年11月，贵州省都匀市某养猪场出现死亡病例，通过临床症状观察，怀疑存在多种病原感染，特进行实验室病原学检查诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料发病猪场送检的病死猪2头，无菌采集肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、淋巴结作为检测病料。

1.1.2 主要试剂(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒通用型实时荧光定量PCR检测试剂盒，均购自北京世纪元亨公司。(2)DNA/RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker试剂，购自大连宝生物工程有限公司。(3)培养基、药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组织样品DNA/RNA提取取病料肺脏、肾脏、脾脏、淋巴结进行匀浆，反复冻融3次，然后12 000 r/min 离心10 min，取上清液100 μL，用DNA/RNA试剂盒提取总DNA/RNA。

1.2.2 病毒核酸检测以提取的猪组织样品核酸为模板，分别应用猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒通用型实时荧光定量PCR检测试剂盒、猪圆环病毒2型PCR试验对相关病毒核酸进行检测。

1.2.3 细菌分离鉴定与药物敏感试验无菌操作对病料肝脏、肺脏、肾脏、脾脏组织样品进行细菌分离培养与初步鉴定，并将纯化细菌进行分子生物学鉴定和纸片法药物敏感试验。

2 结果

2.1 病毒核酸检测结果

2.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测由图1可见：阳性对照Cq值为11，1号样品Cq值为22，2号样品 Cq值为23，2份检测组织均为阳性，提示存在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。

2.1.2 猪瘟病毒核酸检测由图2可见：阳性对照Cq值为32，2份检测组织样品Cq值均为0，提示无猪瘟病毒感染。

2.1.3 猪伪狂犬病病毒核酸检测由图3可见：阳性对照Cq值为24，2份检测组织样品Cq值均为0，提示无猪伪狂犬病病毒感染。

2.1.4 猪圆环病毒2型核酸检测由图4可见：2份检测组织样品PCR均扩增出大小为353 bp目的基因片段，与预期扩增片段大小相符，表明存在猪圆环病毒2型感染。

2.2 细菌分离鉴定结果

2.2.1 细菌分离培养病料组织样品经37 ℃ 24 h培养，在2头猪组织样品中均分离出细菌，分离菌在普通琼脂培养基上菌落呈中等大小、表面光滑、边缘不整齐、半透明、圆形，在血琼脂培养基上菌落出现α溶血。

2.2.2 细菌鉴定

2.2.2.1 革兰氏染色革兰氏染色镜检可见分离菌为革兰氏阴性杆菌，大小形态不一，为单个或成对的杆状、球杆状、长杆状等多种形态。

2.2.2.2 16S rRNA测序及系统进化树鉴定纯化细菌扩增出大小约1 500 bp的16S rRNA基因特异性条带(见图5)，与预期结果相符。将16S rRNA进行测序，采用Megline软件将分离菌株(命名为：GZ-DY株)序列与参考菌株序列进行同源性和系统进化树分析。结果显示：分离菌株与14株奇异变形杆菌核苷酸同源性高达100%，且进化关系近，因此鉴定分离菌为奇异变形杆菌。见图6、图7。

2.2.3 药物敏感试验由表1可见：分离细菌对硫酸安普霉素、硫酸粘菌素、盐酸大观霉素+盐酸林可霉素、氟苯尼考较敏感；对其他药物产生耐药。

表1 分离细菌药敏试验结果

3 结论

通过病毒核酸检测和细菌分离鉴定，确诊该猪场病例为猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、奇异变形杆菌混合感染；分离的奇异变形杆菌对多种药物产生耐药。

4 讨论

4.1近年来，猪病的流行特点日益复杂，多病原混合、继发、协同感染越来越普遍。猪繁殖与呼吸综合征发病时常并发或继发2型猪圆环病毒病、猪伪狂犬病等传染性疾病，其中猪繁殖与呼吸综合征和2型猪圆环病毒病混合感染较为典型[5]。2型猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征均属于免疫抑制性疾病，猪群感染后免疫系统遭到攻击，造成免疫机能下降，二者的协同并发加重猪免疫机能下降的程度，引起断奶仔猪多系统衰弱综合征 (PMWS)，易导致仔猪消瘦、生长缓慢[6，7]。目前，对此混合感染尚无特效治疗药物，只能通过注射疫苗免疫达到预防的目的[8]。在防制方面，猪场应对发病猪进行隔离饲养，假定健康猪紧急接种此2种疫苗；病死猪及污染物彻底焚烧或深埋无害化处理，对污染的圈舍和周围环境进行严格消毒，并带猪消毒；对新购猪进行严格的隔离和检疫，隔离期间进行相关病原的血清学抗体检测。

4.2奇异变形杆菌 (Proteusmirabilis，PM) 属于肠杆菌科，变形杆菌属，是条件性致病菌，为人兽共患病原菌。该菌广泛存在于水、土壤等环境中，易感动物为猪、鸡、犬和羊等[9]。猪感染发病时临床表现为高热、腹泻、呕吐、气喘等症状，严重时可因败血症而死亡[10]。临床上多采用抗生素治疗，但是由于抗生素的大量使用，不断有新的耐药菌株出现，加大了奇异变形杆菌治疗的难度[11]。奇异变形杆菌的多重耐药性已成为临床治疗中一个非常棘手的问题。抗菌药物使用前应进行药敏试验，根据药敏试验指导用药，以达到控制感染的目的，同时要注意抗菌药物交替使用，防止产生耐药性。