非刚竹属5种竹子丛枝病病原菌的分离和鉴定

耿显胜 舒金平 盛建立 张 威 彭 瀚

(1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 杭州 311400； 2. 杭州市富阳区大源镇林业管理站 杭州 311400)

竹子是禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)竹类植物的总称，全世界有1 400多种。我国是世界上竹子分布最广、种类最多的国家之一，竹林总面积约340万hm2，竹类植物达500多种(Daietal.， 2016; Clarketal.， 2015; 江泽慧, 2002)。竹子是重要的森林资源之一，具有生长和成林速度快、产量高、再生能力强、经济价值高等特点，深受林农欢迎而得到大面积推广种植；然而，在竹子生产经营和种质资源保存过程中，竹子病害常年发生。据统计，在我国有186种病原菌造成140多种竹子病害，包括丛枝病、枯梢病、基腐病、秆褐腐病、叶锈病、秆锈病、黑粉病、赤团子病、黑痣病等(徐梅卿等, 2006)，其中以竹子丛枝病发生最为普遍。丛枝病会造成竹子长势衰弱、出笋减少，严重者甚至整株枯死，影响了竹子生长和竹林的可持续经营(Kaoetal.， 1976; 江泽慧, 2002)。

在中国、日本、印度和韩国，均有竹子丛枝病发生的报道，且早期报道仅局限于刚竹属(Phyllostachys)竹种。Tsuda等(1997)对日本竹种园丛枝病进行调查发现，倭竹属(Shibataea)、业平竹属(Semiarundinaria)、苦竹属(Pleioblastus)和赤竹属(Sasa)竹种也会感染丛枝病，其后又有学者在短穗竹属(Brachystachyum)、牡竹属(Dendrocalamus)、茶竿竹属(Pseudosasa)和巴山木竹属(Bashania)竹种上发现丛枝病，从而将病原菌的寄主范围延伸到9个属的竹种(Yadavetal.， 2016; 程燕林等, 2009; 耿显胜等, 2017a)。引起竹子丛枝病的病源菌很多，自1908年首次分离和鉴定竹子丛枝病病原菌以来，现已发现的病原菌有竹针孢座囊菌(Aciculosporiumtake)、植原体(CandidatusPhytoplasma)、箬竹异香柱菌(Heteroepichloёsasae)、箣竹异香柱菌(Heteroepichloёbambusae)和竹暗球腔菌(Phaeosphaeriabambusae)5类(杨永刚等, 2011)。病原菌的寄主范围分析表明，刚竹属竹种丛枝病的病原菌主要是竹针孢座囊菌，而非刚竹属竹种除针孢座囊菌外，植原体、箣竹异香柱菌、箬竹异香柱菌也会使其发病(Tsudaetal.， 1997; Tanakaetal.， 2002; Suryanarayanaetal.， 2009; Yadavetal.， 2016; 程燕林等, 2009)。因此，对非刚竹属竹种丛枝病病原菌进行鉴定，有助于明确非刚竹属竹种病害发生的本质，为病害的科学防控提供指导。

本研究在浙江省庙山坞竹种园和云南省西双版纳傣族自治州中国科学院西双版纳热带植物园采集茶竿竹属、巴山木竹属、业平竹属、牡竹属和绿竹属(Dendrocalamopsis)5种发生丛枝病的竹子样品，采用组织分离法从5种样品上分离病原菌，依据病原菌的培养性状和形态特征，结合分子生物学方法对病原菌进行物种鉴定，并基于ITS rDNA(internal transcribed spacer sequences of ribosomal DNA, ITS rDNA)和LSU rDNA(nuclear large subunit ribosomal DNA, LSU rDNA)序列探讨病原菌与麦角菌科(Clavicepitaceae)其他真菌间的系统发育关系,以期为竹子丛枝病病原菌的鉴定、病害的防控和麦角菌科物种间亲缘关系的确定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017年5月，在浙江省庙山坞竹种园(120°0′35″E，30°5′54″N)采集中华业平竹(Semiarundinariasinica)、巴山木竹(Bashaniafargesii)和薄箨茶竿竹(Pseudosasaamabilisvar.tenuis)样品各6份，其中5份为表现丛枝病症状样品，1份为健康样品。2017年9月，在中国科学院西双版纳热带植物园(101°15′9″E，21°55′49″N)采集牡竹(Dendrocalamusstrictus)和黄麻竹(Dendrocalamopsisstenoaurita)样品，其中牡竹为5份感病样品和1份健康样品，黄麻竹为1份感病样品和1份健康样品。样品编号后置于自封袋中，带回实验室。每份样品取部分提取DNA，剩余用于病原菌分离。试验中用到的泡桐(Paulownia)丛枝病样品采集自中国林业科学研究院亚热带林业研究所试验林地，竹针孢座囊菌标准菌株购买于中国林业微生物菌种保藏中心。

1.2 5种感病竹子植原体病原检测

采集的5种竹子丛枝病样品和健康样品以及泡桐丛枝病样品，使用天根植物基因组提取试剂盒(DP305)提取总DNA。从总DNA中取1 μL用作PCR扩增的模板，采用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2(表1)进行巢式PCR扩增，以检测样品是否存在植原体病原。巢式PCR扩增的反应体系和条件同耿显胜等(2017b)。

表1 引物名称和序列Tab.1 Primer name and sequence

1.3 5种感病竹子病原菌的分离、形态结构和培养性状观察

采集的5种竹子丛枝病样品在流水下冲洗2 h，用无菌剪刀将其剪成小段，依次使用75% 乙醇洗涤30 s、10% 次氯酸钠洗涤10 min、无菌水洗涤5次。洗涤后将样品转移到无菌滤纸上，吸干表面残留水分，转接到含链霉素(200 mg·L-1)的PDA固体培养基上，25 ℃暗培养，观察病原菌在PDA培养基上的培养性状和生长状况。

菌落大小使用毫米刻度尺测量，病原菌菌丝和分生孢子使用VHX5000显微镜观测，在观察中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹病原菌的分生孢子前，使用麦氏试剂(Melzer’s reagent)(Leonard, 2006)对PDA平板上的病原菌进行染色。

1.4 5种感病竹子病原菌总DNA的提取、分子鉴定和系统发育分析

使用无菌吸头从PDA平板上刮取分离培养和购买的病原菌菌丝或分生孢子，转移到2 mL离心管中，充分研磨粉碎，使用植物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总DNA。采用引物对LR0R/LR5(表1)扩增病原菌LSU rDNA的D1—D2区域约900 bp片段(Eberhard, 2012)。PCR扩增使用的反应体系为： 2 × PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各0.5 μL，模板1 μL，加ddH2O 补足20 μL。PCR的反应条件为： 95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性35 s，52 ℃退火55 s，72 ℃延伸60 s； 72 ℃延伸10 min，循环数35。采用引物对ITS1F/ITS4(表1)扩增病原菌ITS rDNA序列约600 bp片段，PCR扩增使用的反应体系和条件同耿显胜等(2017b)。取5 μL PCR产物，使用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪上照相记录结果。

PCR扩增阳性产物送至铂尚生物技术(上海)有限公司测序。测序序列使用DNAMAN 6.0进行比对分析，确定序列之间的同源性；使用BLASTN进行在线比对分析，在NCBI数据库中找到并下载与其具有很高相似性的麦角菌科真菌序列。测定的序列以及网上下载的序列使用MEGA 6.0(Tamuraetal.， 2013)进行序列比对，删除两端不整齐的序列，采用邻位相连法(NJ)构建系统发育树。另外，在构建系统发育树时，选择球囊孢壳属(Heleococcum)的日本球囊孢壳菌(H.japonicum)作为外群。

2 结果与分析

2.1 5种感病竹子植原体病原检测结果

本研究提取了5种竹子丛枝病样品和健康样品以及泡桐丛枝病样品的总DNA，共计27份。采用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2对提取的总DNA进行巢式PCR扩增，PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶进行电泳分析。结果发现，感病泡桐总DNA样品能够扩增出约1 200 bp的条带，而所有5种竹子总DNA样品均不能够扩增出清晰的约1 200 bp的条带(图1A、B)，这表明竹子总DNA样品中没有植原体DNA存在，即本研究中5种竹子丛枝病的病原菌非植原体。

2.2 5种感病竹子病原菌的分离、形态结构和培养性状

采用组织分离法，从中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹丛枝病组织中分离到12株病原菌。表面消毒后的外植体在PDA培养基上培养2～3天后，长出米白色物质，将其转接到PDA平板上继续培养，直到形成较大的菌落。该菌落正面为浅黄色，表面具有凹凸不平的褶皱、略有光泽、边缘不整齐(图2A、B)，与购买的竹针孢座囊菌标准菌株的菌落特征一致。VHX5000显微镜下观察，该菌落为病原菌的分生孢子。分生孢子通过麦氏试剂染色发现，培养基被染成蓝紫色，而分生孢子呈白色(图2C)。分生孢子针状，大小为(22.4～52.0) μm × (2.2～6.0) μm，平均为30.7 μm × 3.8 μm。在PDA培养基上生长38天后，菌落周围长出白色菌丝，是病原菌分生孢子萌发形成的无性菌丝(图2B)。

图1 巢式PCR扩增植原体16S rRNA基因片段Fig.1 Nested PCR amplification of 16S rRNA gene fragment of phytoplasmaA:中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹丛枝病样品总DNA进行巢式PCR扩增 Nested PCR amplification of 16S rRNA gene fragment from genomic DNA extracted from S. sinica, B. fargesii and P. amabilis var. tenuis. M: DL2000 marker; 1—5: 感病中华业平竹Infected S.sinica; 6: 健康中华业平竹 Healthy S. sinica; 8—12: 感病巴山木竹Infected B. fargesii; 13: 健康巴山木竹Healthy B. fargesii; 15—19: 感病薄箨茶竿竹Infected P. amabilis var. tenuis; 20: 健康薄箨茶竿竹 Healthy P. amabilis var. tenuis; 7,14,21: 感病泡桐 Infected Paulownia. B:牡竹和黄麻竹丛枝病样品总DNA进行PCR扩增的电泳Nested PCR amplification of 16S rRNA gene fragment from genomic DNA extracted from D. stenoaurita and D. strictus. M: DL2000 marker; 1—5: 感病牡竹Infected D. strictus; 6: 健康牡竹Healthy D. strictus; 8: 感病黄麻竹Infected D. stenoaurita; 9: 健康黄麻竹Healthy D. stenoaurita; 7,10: 感病泡桐Infected Paulownia.

图2 5种竹子丛枝病病原菌的形态结构和培养性状Fig.2 The morphological features and culture characteristics of the pathogens causing witches’broom disease of 5 bamboo speciesA—C：感病中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹上分离的病原菌分生孢子(A和C)及菌丝(B)The mycelia (B) and conidia (A and C) of the pathogen isolated from S. sinica, B. fargesii and P. amabilis var. tenuis. D—F：感病黄麻竹和牡竹上分离病原菌的菌丝(D和E)及分生孢子(F)The mycelia (D and E) and conidia (F) of the pathogen isolated from D. stenoaurita and D. strictus.

采用组织分离法，从黄麻竹和牡竹丛枝病组织中分离到11株病原菌。这些病原菌菌丝具有相似的形态结构和培养性状，其在PDA培养基上形成的菌落正面为白色，背面为浅黄色。菌落呈圆形，表面平整，边缘整齐(图2D、E)。菌丝生长速度较慢，培养35天时菌落平均直径仅为(2.70±0.77) cm。在PDA培养基上连续培养72天后产生短棒状分子孢子略有弯曲，大小为(5.4～10.5) μm ×(1.2～2.8) μm，平均为7.4 μm × 1.8 μm(图2F)。

2.3 5种感病竹子原菌的分子鉴定和系统发育分析

2.3.1 病原菌LSU rDNA序列的PCR扩增和系统发育分析 以5种竹子丛枝病病原菌的总DNA为模板，采用引物对LR0R/LR5进行PCR扩增，分离的23个菌株中22个都能够扩增出特异性条带(图3)，且扩增的条带约为900 bp，与预期的条带大小和竹针孢座囊菌标准菌株的条带大小一致(图3，泳道13)。扩增出的PCR产物进行纯化、测序和序列分析，得到中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹丛枝病病原菌12个菌株一致的892 bp序列(GenBank登录号： MK691594)，该序列为病原菌的LSU rDNA D1—D2区域片段。而牡竹和黄麻竹丛枝病病原菌的11个菌株，测序得到一致的909 bp LSU rDNA D1—D2区域片段(GenBank登录号： MK691595)。序列比对发现，2种病原菌的LSU rDNA D1—D2之间有42个脱氧核苷酸的差异，同源性为95.25%。

将测序结果用在线NCBI数据库进行比对分析，获得与竹子丛枝病病原菌LSU rDNA具有很高相似性的麦角菌科真菌序列。使用MEGA 6.0 进行序列比对，删除两端不整齐的序列，邻位相连法构建系统发育树，确定麦角菌科真菌间的亲缘关系。由系统发育树(图4)可以看出，分离自中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹的丛枝病病原菌与麦角菌属(Claviceps)数个菌株聚为一支，支持率为82%，亲缘关系很近；而分离自牡竹和黄麻竹的丛枝病病原菌与肉瘤座菌属(Balansia)数个菌株聚为一支，支持率为58%，亲缘关系很近。

图3 5种竹子丛枝病病原菌LSU rDNA的PCR扩增Fig.3 PCR amplification of LSU rDNA fragment from genomic DNA extracted from the pathogens causing witches’ broom disease of 5 bamboo speciesM: DL2000 marker; 1—12: 中华叶平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹分离的12株病原菌The pathogen strains isolated from S. sinica, B. fargesii and P. amabilis var. tenuis; 13: 竹针孢座囊菌标准菌株Aciculosporium take; 14—24: 牡竹和黄麻竹丛枝病病原菌的11个菌株The pathogen strains isolated from D. stenoaurita and D. strictus.

图4 基于LSU rDNA序列构建的麦角菌科系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree inferred from the neighbor-joining (NJ) analysis based on the LSU rDNA dataset

2.3.2 病原菌ITS rDNA序列的PCR扩增和系统发育分析 采用引物对ITS1F/ITS4对5种竹子丛枝病病原菌的总DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，分离的23个菌株都能够扩增出特异性条带，预期的条带大小约700 bp(图5)。扩增出的PCR产物经纯化、测序和序列分析，得到中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹丛枝病病原菌12个菌株的536 bp序列(GenBank登录号： MK874908)，所有12个菌株536 bp序列的同源性为100%，属同一物种，该序列包括18S rDNA的57 bp序列、ITS1的141 bp序列、5.8S rDNA的157 bp序列、ITS2的164 bp序列和28S rDNA的17 bp序列。而牡竹和黄麻竹丛枝病病原菌的11个菌株获得538 bp序列(GenBank登录号： MK874907)，所有11个菌株538 bp序列的同源性为100%，属同一物种，该序列包括18S rDNA的58 bp序列、ITS1的137 bp序列、5.8S rDNA的157 bp序列和ITS2的186 bp序列。序列比对发现，2种病原菌的ITS1 + ITS2序列间有96个脱氧核苷酸的差异，同源性为70.73%； 而2种病原菌的5.8S rDNA序列具有高度保守性，其长度一致，仅有6个脱氧核苷酸的差异，同源性为96.18%。

将测序结果用在线的NCBI数据库进行比对分析，获得与竹子丛枝病病原菌ITS rDNA具有很高相似性的麦角菌科真菌序列。使用MEGA 6.0 进行序列比对，删除两端不整齐的序列，邻位相连法构建系统发育树，确定麦角菌科真菌间的亲缘关系。由系统发育树(图6)可以看出，分离自中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹丛枝病病原菌与竹针孢座囊菌聚为一支，支持率为99%，故该病原菌为竹针孢座囊菌；而分离自牡竹和黄麻竹丛枝病病原菌与箣竹异香柱菌(Heteroepichlo⊇bambusae)聚为一支，支持率为100%，故该病原菌为箣竹异香柱菌。

图5 5种竹子丛枝病病原菌ITS rDNA的PCR扩增Fig.5 PCR amplification of ITS rDNA fragment from genomic DNA extracted from the pathogens causing witches’ broom disease of 5 bamboo speciesM: DL2000 marker; 1—12: 中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹分离的12株病原菌The pathogen strains isolated from S. sinica, B. fargesii and P. amabilis var. tenuis;13: 竹针孢座囊菌标准菌株A. take; 14—24: 牡竹和黄麻竹丛枝病病原菌的11个菌株The pathogen strains isolated from D. stenoaurita and D. strictus.

图6 基于ITS rDNA序列构建的麦角菌科系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree inferred from the neighbor-joining (NJ) analysis based on the ITS rDNA dataset

3 讨论

竹子丛枝病是竹类植物上的一种重要病害，早期研究者认为只发生于刚竹属，后来，在非刚竹属的倭竹属、业平竹属、苦竹属、赤竹属、巴山木竹属、牡竹属竹种上也发现丛枝病，表明丛枝病是一种非常普遍的竹子病害(Tsudaetal.， 1997; Yadavetal.， 2016; 程燕林等, 2009; 耿显胜等, 2017a)。本研究采集的5种竹子样品是刚竹属以外的5个属，其中绿竹属(Dendrocalamopsis)为首次报道发生丛枝病的属。对5种竹子丛枝病样品提取总DNA，使用植原体特异性引物进行巢式PCR扩增，未检测出植原体，表明本研究5种竹子丛枝病不是由植原体引起的。在印度，Suryanarayana等(2009)和Yadav等(2016)使用巢式PCR法从感病牡竹中检测到植原体，而本研究采集于中国云南省的感病牡竹其病原菌却不是植原体。

采用组织分离法分离竹子丛枝病病原菌，在浙江省采集的中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹感病样品中分离到12个菌株，菌株的菌丝和分生孢子与竹针孢座囊菌标准菌株一致； 在云南省采集的牡竹和黄麻竹分离到11个菌株，在显微镜下可观察到白色的菌丝和短棒状的分生孢子，其形态结构与竹针孢座囊菌标准菌株不同，表明牡竹和黄麻丛枝病病原菌非竹针孢座囊菌。

病原菌ITS rDNA序列分析发现，中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹感病样品12个菌株的536 bp序列一致，表明该病原菌的ITS rDNA序列具有很高的保守性；基于ITS rDNA序列的系统发育分析发现，该病原菌与竹针孢座囊菌聚为同一支，进一步证明中华业平竹、巴山木竹和薄箨茶竿竹丛枝病病原菌为竹针孢座囊菌。早在1988年，我国学者就从感病的槽里黄刚竹(Phyllostachysviridis)和淡竹(Phyllostachysglauca)样品上分离到竹针孢座囊菌(朱煕樵等， 1988)，当时该菌被归类为肉瘤座菌属(Balansia)的竹瘤座菌(Balansiatake)；其后的分子分类数据表明，该菌与肉瘤座菌属的亲缘关系远，而与麦角菌属的亲缘关系近，《真菌词典》第10版将该菌归类为竹针孢座囊菌属竹针孢座囊菌，目前中英文文献均采用竹针孢座囊菌这一种名。牡竹和黄麻竹感病样品11个菌株的ITS rDNA序列分析和系统发育分析得到一致的538 bp序列，该序列与箣竹异香柱菌聚为一支，表明该病原菌为箣竹异香柱菌。病原菌LSU rDNA系统发育分析表明， 竹针孢座囊菌与麦角菌属的亲缘关系最近，与Tanaka 等(2008)基于ALDH1-1序列确定的系统发育关系一致； 箣竹异香柱菌与肉瘤座菌属的亲缘关系最近，而与香柱菌属(Epichlo⊇)的亲缘关系较远，与Tanaka等(2002)的研究结果一致。

4 结论

本研究采用组织分离法分离到非刚竹属5种竹子丛枝病病原菌，并结合依据病源菌的培养性状和形态特征，形态学和分子生物学方法对病原菌进行物种鉴定，并对病原菌进行系统发育分析。结果表明， 巴山木竹、薄箨茶竿竹和中华业平竹丛枝病病原菌为竹针孢座囊菌，黄麻竹和牡竹丛枝病病原菌为箣竹异香柱菌。竹针孢座囊菌与麦角菌属的亲缘关系最近，箣竹异香柱菌与肉瘤座菌属的亲缘关系最近，与香柱菌属的亲缘关系较远。本研究首次在绿竹属竹种上发现丛枝病，研究结果可为竹子丛枝病病原菌的鉴定、杀菌剂的筛选和病害的科学防控提供基础，同时对于麦角菌科菌种间亲缘关系的确定也具有重要意义。