FoxO1过表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其机制

鲁莉，潘虹，石朋飞

武汉市中心医院，武汉430014

甲状腺癌是一种内分泌恶性肿瘤，可分为甲状腺乳头状癌(PTC)、滤泡性甲状腺癌、髓样甲状腺癌和未分化间变性甲状腺癌[1]。其中PTC占所有甲状腺恶性肿瘤的80%[2，3]。PTC的病因和发病机制尚不清楚，探索PTC发生发展的潜在分子机制可能为临床治疗提供新的思路。转录因子叉头盒蛋白O1(FoxO1)是FOXO家族的重要成员之一，参与细胞增殖、细胞周期控制、细胞凋亡、细胞分化、代谢和DNA损伤修复等多种功能调控[4]。研究显示，FoxO1在许多人类恶性肿瘤中表达下调，包括乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤等[5～7]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路已被证明在PTC的进展过程中发挥重要作用[8，9]。FoxO1的活性受PI3K/Akt通路调控。PI3K/Akt在多个位点磷酸化FoxO1，使FoxO1进入细胞质，从而降低其转录活性[10]。Bim是PI3K/Akt信号通路的下游靶点，Bim是Bcl-2家族中仅含一个BH3结构域的蛋白，具有促凋亡活性，参与多种不同类型细胞的凋亡调控。2018年7月～2019年3月，本研究观察了过表达FoxO1对甲状腺乳头状癌细胞KTC-1增殖、凋亡和细胞周期的影响，并初步探讨了相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 甲状腺乳头状癌细胞株KTC-1(上海中科院细胞库)；RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素(美国Gibco公司)；FoxO1过表达慢病毒载体pLV-FoxO1、空载体pLV-control(上海吉玛制药技术有限公司)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)；PI单染细胞周期检测试剂盒(上海凯基公司)；全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗人FoxO1、PI3K、Akt、p-Akt(ser473)、Bim及GAPDH一抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(英国Abcam公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)；全自动化学发光分析仪(上海天能公司)。

1.2 细胞分组及慢病毒转染 取处于对数生长期的KTC-1细胞并用胰酶消化处理，离心收集后，以1.0×105/mL将细胞重悬于培养液中并接种于6孔板中，于37 ℃、5% CO2条件培养箱中培养至细胞融合度达40%。随机将6孔细胞分成对照组和过表达组，每组3个平行复孔。对照组感染pLV-Control慢病毒，过表达组感染pLV-FoxO1慢病毒(感染复数值均为100)。感染72 h后，显微镜下观察细胞荧光表达情况，当荧光表达率大于90%时，提取两组细胞总蛋白，Western blotting法检测FoxO1蛋白。过表达组FoxO1蛋白相对表达量高于对照组(分别为0.67±0.08、0.24±0.05，P<0.05)，提示FoxO1基因在KTC-1细胞成功过表达。

1.3 细胞增殖能力观察 采用MTT法和克隆形成实验观察细胞增殖能力。①MTT法：将两组细胞以1.0×104/孔接种于6孔板中，每组设置3个平行复孔，记录0 h时细胞在490 nm处的光密度值(OD值)；在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养48 h，按MTT试剂盒说明操作，测量各孔细胞在490 nm处的OD值。细胞增殖率=(OD48 h-OD0 h)/OD0 h×100%。②克隆形成实验：将两组细胞以胰酶消化后重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，以100/皿分别接种于含37 ℃预温培养液(10 mL)的培养皿中，轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养2周，期间每3 d观察一次细胞生长状况并换液；当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养；弃去上清液，用PBS浸洗2次，加5 mL的4%多聚甲醛固定细胞15 min，去固定液，结晶紫染液染色10～30 min，流水缓慢洗去染色液，干燥后观察拍照，计算克隆形成数。

1.4 细胞凋亡情况观察 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测细胞凋亡。取两组细胞以1.0×104/孔接种于6孔板中，每组设置3个平行复孔，共培养48 h。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI双染试剂盒说明操作：1 000 g离心5 min，弃上清，收集细胞；加入1 mL预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1 000 g、4 ℃离心5 min，弃上清，重复2次；将细胞重悬于200 μL的Binding buffer；加入10 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，轻轻混匀，4 ℃避光孵育30 min；加入300 μL的Binding Buffer，随即进行流式细胞仪检测，使用CXP软件分析并记录结果。凋亡率=第二象限B2细胞占比+第四象限B4细胞占比。

1.5 细胞周期分布观察 PI单染检测细胞周期。取两组细胞以1.0×104/孔接种于6孔板中，每组设置3个平行复孔，共培养48 h。按照PI细胞周期流式检测试剂盒说明书进行操作：收集细胞，胰蛋白酶消化；用1×PBS溶液浸洗2次，移至1.5 mL离心管中；加入冰冷70%乙醇3 mL固定细胞，4 ℃放置24 h；用冷PBS清洗细胞2次，1 000 g离心5 min，弃上清；加入1 mL的PI染液(含RNase)，轻轻震荡混匀，室温下避光放置30 min；用流式细胞仪上机检测；CXP软件分析并记录结果。

1.6 PI3K/Akt/Bim信号通路相关蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集培养48 h后的各组细胞，采用全蛋白提取试剂盒提取蛋白。用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。取20 μg蛋白和4 μL的2×SDS上样缓冲液混合均匀，100 ℃变性10 min。上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h。PBS洗膜后，分别加入一抗(PI3K、p-Akt、Akt、Bim和内参GAPDH，稀释比均为1∶1 000)4 ℃孵育过夜。PBS洗膜，加入HRP标记的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育0.5 h。PBS洗膜，ECL试剂显色。采用Quantity One图像分析软件进行灰度值分析，以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞增殖能力比较 过表达组、对照组细胞增殖率分别为33.21%±6.78%、79.37%±8.49%，克隆形成数分别为(28.67±4.50)、(66.33±7.36)个/皿。过表达组细胞增殖率、克隆形成数均低于对照组(P均<0.05)。

2.2 两组细胞凋亡率比较 过表达组、对照组细胞总凋亡率分别为69.47%±12.35%、27.22%±6.49%，过表达组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)。

2.3 两组细胞周期分布比较 过表达组、对照组G0/G1期细胞比例分别为79.57%±10.34%、51.26%±8.41%，过表达组G0/G1期细胞比例高于对照组(P<0.05)。

2.4 两组细胞中PI3K/Akt/Bim信号通路相关蛋白表达比较 过表达组PI3K蛋白表达及p-Akt/Akt水平低于对照组，Bim蛋白表达高于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组细胞中PI3K/Akt/Bim信号通路相关蛋白表达比较

3 讨论

PTC是临床甲状腺癌最常见的类型，目前临床治疗PTC的主要方法是手术切除[11]。遗传学改变是PTC发生、发展的主要驱动力之一，如RAS、B-Raf原癌基因突变被认为与PTC的临床参数(进展、侵袭和复发)之间存在重要关联[12]。更多参与PTC进展的新靶点需要被发现，这些靶点可作为诊断和预后的生物标志物，并为治疗PTC提供依据。先前证据表明，FoxO1在包括PTC在内的许多人类正常组织和肿瘤组织中均有差异表达[5，6]。在宫颈癌中，FoxO1被证明通过诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡抑制肿瘤的发生、发展[13]。然而，FoxO1在人PTC发生中的作用机制尚不清楚。

为了观察FoxO1过表达对PTC的影响，我们在PTC细胞株KTC-1中感染了FoxO1过表达的慢病毒，结果发现FoxO1蛋白的表达量显著提升；且FoxO1表达上调可抑制细胞增殖，促进细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。同时，经典霍奇金淋巴瘤相关研究发现，持续活跃的FoxO1异位表达能诱导细胞凋亡、阻止其增殖，并伴随着显著的G0/G1期细胞阻滞[14]。此外，FoxO1在人非小细胞肺癌中显著低表达，FoxO1过表达增加了肿瘤细胞表面微绒毛的长度，进而抑制其迁移；FoxO1沉默则显著缩短了微绒毛的长度，促进细胞迁移。这提示FoxO1同样参与人肺癌的发生。在人骨肉瘤细胞中，研究者发现FoxO1通过MALAT1的负调控抑制肿瘤细胞增殖和迁移，上调FoxO1表达可作为骨肉瘤患者的一种替代治疗策略[15]。同样，人肝癌相关研究发现，FoxO1在肝癌组织中显著低表达，FoxO1相关信号通路激活剂甲哌氟丙嗪能促进SMMC-7721、Bel-7402细胞株凋亡，抑制细胞的迁移和侵袭能力，其机制与增加细胞核中FoxO1的表达及调节Bax/Bcl-2比例有关[16]。以上研究提示，FoxO1是包括PTC在内的多种恶性肿瘤的抑癌基因，其表达调控可作为肿瘤分子治疗的重要途径。

现已证实，PI3K/Akt信号通路参与恶性肿瘤发生发展的相关调控。研究表明，FoxO1的活性受PI3K/Akt信号通路的负调节。研究者使用Akt抑制剂处理甲状腺癌细胞24 h后，发现FoxO1蛋白的表达水平显著升高，提示PI3K的激活下调FoxO1蛋白的表达水平。鼻咽癌相关体内体外实验结果显示，FoxO1通过PI3K/AKT/C-JUN信号通路诱导miR-3188的表达并抑制鼻咽癌细胞的增殖[17]。宫颈癌相关研究发现，PI3K抑制剂LY294002显著降低了PI3K磷酸化水平，但激活了FoxO1转录因子，而FoxO1的激活诱导了肿瘤细胞凋亡并抑制细胞增殖[13]。本研究结果显示，过表达组PI3K蛋白表达及p-Akt/Akt水平低于对照组，表明上调FoxO1表达对PI3K/Akt信号通路具有负调节作用，主要表现在Akt磷酸化水平的降低。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展密切相关，这一生物学过程受到多种基因的影响。Bcl-2家族是研究最多的一类凋亡相关蛋白[18]。Bim不仅是PI3K/Akt信号通路的下游靶点，也是Bcl-2家族的成员之一。Bim转录水平调控十分复杂，可受到多种信号途径的调节，其中包括PI3K/Akt信号通路。细胞实验表明，p-Akt活性抑制剂LY294002能促进Bim蛋白表达，提示Bim蛋白表达可能通过PI3K/AKT信号通路来调控[19]。低温致乳鼠心肌细胞损伤的相关研究表明，低温能够通过促进Bim表达诱导心肌细胞凋亡，而PI3K/AKT信号通路同样可能参与了Bim的诱导表达[20]。本实验结果显示，过表达组Bim蛋白表达高于对照组，表明外源性的FoxO1上调同样增加了Bim蛋白的表达水平。FoxO1过表达可能通过调控PI3K/Akt/Bim信号通路影响PTC细胞的增殖、凋亡。

综上所述，FoxO1过表达后PTC细胞增殖能力降低、凋亡水平升高、G0/G1期阻滞细胞明显增多，其作用机制可能涉及PI3K/Akt/Bim信号通路的活性调控。更加详细的分子生物学机制尚有待进一步深入探讨。