酶解木质素质量浓度对纳米木质素粒子结构及载药行为的影响*

周 宇 韩雁明 李改云 储富祥

(中国林业科学研究院木材工业研究所 北京 100091)

中空纳米球具有密度低、比表面积大、渗透性好和稳定性高等特点，在医学和工业领域拥有广阔的应用前景(Sietal.， 2016； Xuetal.， 2016)。木质素是一种价格低廉、产量巨大的可再生生物质资源，结构中含有甲氧基、羰基、羧基、酚羟基和脂族羟基等多种基团，已成为生物基新材料开发中的候选原材料(Duvaletal.， 2014； Laurichesseetal.， 2014； 熊福全等， 2016)； 同时，木质素还具有良好的生物降解性、生物相容性和热稳定性，也是药物传递所需潜在材料之一(Figueiredoetal.， 2017； Lietal.， 2016； 金克霞等， 2018)。酶解木质素(enzymatic hydrolysis lignin，EHL)作为一种生物质炼制的副产品，近些年随着生物质炼制行业的发展，产量逐年增加。研究表明，当两亲性EHL溶解在选择性溶剂中时，会产生微观相分离而发生自组装，形成核壳结构的胶束(Hongetal.， 2015)，这为EHL的高值化应用提供了一种简单可行的途径。

目前，基于天然和合成聚合物的纳米粒子已为改善抗癌药物传输提供了一种有效路径。作为药物的承载体，纳米粒子一般通过渗透率和滞留效应增加药物的溶解度，扩展循环时间，增强肿瘤对药物的吸收(Davisetal.， 2008； Samaletal.， 2012； Zhaoetal.， 2013)。阿霉素是一种广泛应用的抗肿瘤活性抗生素，但由于该药物不能直接深入肿瘤组织且对心脏等器官具有很强的毒副作用，导致其治疗效果有限(Carvalhoetal.， 2009； Gongetal.， 2017； Hussainetal.， 2013； McRaeetal.， 2014)。因此，在运送阿霉素到肿瘤部位的过程中，如何降低其在非肿瘤部位的药物暴露，是实现阿霉素有效利用需要解决的一项重大挑战，开发将阿霉素运载到肿瘤组织的有效纳米载体已成为当前的研究热点之一(Figueiredoetal.， 2016； Monthaetal.， 2016； Scheerenetal.， 2016)。

本研究以酶解木质素为原材料，将其溶解在四氢呋喃(tetrahydrofuran，THF)中，通过自组装制备纳米木质素中空粒子(lignin hollow nanoparticles，LHNPs)，探讨木质素初始质量浓度对纳米木质素结构和稳定性的影响，并利用纳米木质素包载抗癌药物盐酸阿霉素，研究载药纳米粒子的药物释放行为，以期为中空开口聚合物纳米粒子的结构控制和药物控释等技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

酶解木质素(EHL)购于香港来禾生物技术有限公司(经THF提纯后，羟基含量为2.57 mmol·g-1； GPC测定的分子质量为532，多分散系数为1.34)，四氢呋喃(THF，分析纯)购于北京化学试剂厂，盐酸阿霉素(DOX.HCl)购于上海麦克林生化科技有限公司。JEM-1400Plus透射电子显微镜，日本电子； S-4800扫描电子显微镜，日本Hitachi公司； Zetasizer Nano 激光粒度仪，英国Malvern公司； X射线粉末衍射仪，德国布鲁克公司； Nicolet IS10红外光谱仪，美国尼高力公司； UV-3600紫外-可见光分光光度计，日本岛津公司。

1.2 中空开口木质素纳米球的制备

室温下，取一定质量EHL溶解在装有10 mL THF的烧杯中，分别配制质量浓度0.3、1和3 mg·mL-1的木质素溶液。用磁力搅拌器以700 r·min-1的速度搅拌溶液，并用蠕动泵以4 mL·min-1的速度向溶液中滴加去离子水。1 min后，溶液由清澈红棕色变为浑浊黄棕色乳浊液； 继续滴加去离子水，乳浊液颜色逐渐变浅； 40 mL时，液体变为较浅的黄棕色，停止滴加去离子水。继续搅拌12 h后将悬浮液转移至透析袋(MWCO: 12000-14000，Spectrumlabs，USA)中透析，去除残余的THF和游离的木质素分子，透析24 h，中间换水2次。

1.3 盐酸阿霉素的装载和体外释放

将DOX分散在木质素溶液中(mDOX∶mEHL=1∶10)，超声2 min后，以4 mL·min-1的速度滴加去离子水40 mL。此过程中，木质素在自组装成纳米中空粒子的同时会将DOX包裹在LHNPs腔体内，具体过程见图1。24 h后，将悬浮液转移至透析袋中透析24 h，去除TFH和其他游离的分子。最后在11 000 r·min-1转速下离心15 min，用紫外-可见光分光光度计测定480 nm上清液的吸光度来测定DOX的载药量。

图1 DOX@LHNPs的制备过程Fig.1 Preparation process of DOX@LHNPs

图2 不同EHL初始质量浓度制备的LHNPs尺寸表征Fig.2 Size characterization of LHNPs prepared with different EHL mas concentrations

采用PBS(pH7.4，pH5.5)透析法研究DOX从纳米球中的释放行为。取5 mg DOX.HCl、10 mg 载药木质素球浸泡在50 mL PBS溶液中(37 ℃)，振荡，在预定时间间隔内，取5 mL培养基，加入相同量的新鲜PBS溶液。所取样品在11 000 r·min-1转速下离心5 min，用紫外-可见光分光光度计测定DOX的释放量。DOX的载药量(drag loading,DL)和包封率(entrapment efficiency,EE)计算公式如下：

DL(%)=mDOX/mDOX@LHNPs× 100%；

(1)

EE(%)=mDOX/mDOX，T×100%。

(2)

2 结果与分析

2.1 酶解木质素初始质量浓度对LHNPs粒径的影响

在研究EHL初始质量浓度对LHNPs结构和性能的影响时，去离子水滴加速度和磁力搅拌器的转速保持4 mL·min-1和700 r·min-1。由图2A可知，随着木质素初始质量浓度从0.3 mg·mL-1增加到3 mg·mL-1，纳米颗粒直径从552.6 nm减小到266.8 nm，且激光粒度仪测试悬浮液的PDI基本保持稳定。从图2B粒径分布曲线可看出，3种粒子粒径尺寸分布均匀，LHNPs0.3 mg·mL-1比其他2种粒子分布稍宽，表明EHL初始质量浓度较低时，制备的纳米中空粒子粒径均匀性稍差。

2.2 酶解木质素初始质量浓度对LHNPs形状结构的影响

从不同EHL初始质量浓度制备的LHNPs透射电镜图像(图3)可看出，木质素纳米粒子呈球形中空结构，表面开孔，随着EHL初始质量浓度增加，粒子的直径、表面积和孔隙体积均有所减小。这是因为EHL初始质量浓度越高，初期参加自组装的EHL越多，导致壳层壁厚随初始质量浓度增加而增厚； 相反，当初始质量浓度较低时，初期参加自组装的EHL较少，不能迅速形成稳定完整的球形纳米粒子，致使此种条件下制备的纳米中空粒子壳体壁厚较薄，形状分布不均匀。另外，试验结果还显示，LHNPs的产率(LHNPs质量和原EHL质量的比值)随初始质量浓度增加而增大(yield0.3 mg·mL-1=33.5%，yield1 mg·mL-1=62.3%，yield3 mg·mL-1=76.8%)。这是因为低分子质量的EHL不参加自组装过程(Xiongetal.， 2017)，所以初始质量浓度较低时，反应体系中初期参加自组装的EHL更少，导致木质素纳米粒子的产率降低。

2.3 酶解木质素初始质量浓度对LHNPs稳定性的影响

为研究不同EHL初始质量浓度对LHNPs稳定性的影响，本研究跟踪测量悬浮液中纳米粒子随时间的变化。从图4可以看出，3种初始质量浓度制备的纳米粒子平均直径在10天内基本保持不变，粒度分散指数(PDI)在5天内未发生明显改变，5～10天内稍微增大，但PDI小于0.3，这说明木质素纳米粒子在10天内具有很强的稳定性。平均粒径和PDI在15天后增大，其中LHNPs0.3 mg·mL-1变化更为显著。在LHNPs悬浮液体系中，粒子表面羟基和羧基提供的表面电荷使得纳米粒子表面形成能够使粒子保持稳定分散的双电层(Lievonenetal.， 2016)，但是LHNPs的不对称结构会影响其表面的双电层，所以粒子在15天后平均直径增大。由LHNPs0.3 mg·mL-1的TEM可以看出，其形状更不规整，壳层较薄，而且开口较大，所以LHNPs0.3 mg·mL-1的稳定性较差。

图3 不同EHL初始质量浓度制备的LHNPs透射电镜图像以及对应的比表面积和孔隙率Fig.3 TEM images of LHNPs prepared with different EHL mass concentrations and corresponding specific surface area and porosity

图4 LHNPs悬浮液中粒子的粒径和PDI随时间的变化Fig.4 Change in the particles size and PDI of LHNPs after incubation at water over time

2.4 酶解木质素初始质量浓度对LHNPs包封和释放阿霉素行为的影响

图5 LHNPs对DOX的载药量和封装率以及不同pH PBS溶液中阿霉素的体外释放曲线Fig.5 Drag loading and entrapment efficiency of LHNPs for DOX，and in vitro release curve of doxorubicin in different pH PBS solution1. 自由DOX Free drugs, pH5.5; 2. 自由DOX Free drugs, pH7.4; 3.DOX@LHNPs0.3 mg·mL-1, pH5.5; 4.DOX@LHNPs0.3 mg·mL-1, pH7.4; 5.DOX@LHNPs 1 mg·mL-1, pH5.5; 6.DOX@LHNPs 1 mg·mL-1 pH7.4; 7.DOX@LHNPs3 mg·mL-1, pH5.5; 8.DOX@LHNPs 3 mg·mL-1，pH7.4.

大分子中空团聚粒子的结构对其包封和缓释性能具有重要影响(Lietal.， 2010)。通过控制EHL初始质量浓度，可得到不同结构的LHNPs，使得LHNPs具备成为一个选择性载体平台的潜力。LHNPs的载药量(DL)和包封率(EE)如图5A所示，可以看出，LHNPs0.3 mg·mL-1的载药量明显高于其他2种木质素纳米粒子，但其包封率不是最大的。这是因为较大的比表面积和孔隙率可提高中空纳米粒子对DOX的包载能力，LHNPs0.3 mg·mL-1的制备过程产率太低，故其EE不高。为了模拟肿瘤微环境(pH5.5)和生理pH(pH 7.4)，对LHNPs@DOX在2种不同pH PBS溶液中的药物释放行为进行评价，结果如图5B所示，可以看出，2种pH体系的DOX释放行为是不同的。酸性(pH5.5)条件下，自由DOX、载药粒子释放DOX的速度均大于中性(pH7.4)条件下的药物释放速度。60 h后，酸性条件下3种粒子的DOX累积释放量均超过55%，而中性条件下DOX的最高释放量低于45%。另外，在2种pH体系中，同一时刻DOX@LHNPs0.3 mg·mL-1的累积释放量最大，DOX@LHNPs3 mg·mL-1释放稳定性最好。这主要是由于LHNPs的壳层壁厚和表面开口大小引起的，较厚的外壳、较小的表面开口和规整的结构，可以更好保护纳米颗粒免受PBS的溶胀作用，减小粒子表面双电层的破坏。与自由药物的释放曲线比较，载药纳米粒子具有对DOX的持续释放效果。

2.5 载阿霉素LHNPs的形貌和尺寸

图6A、B、C为EHL、LHNPs和DOX@LHNPs的SEM，插图为对应的TEM(根据纳米球稳定性、载药量和释放速率选取得最优制备方案： EHL初始质量浓度为1.0 mg·mL-1，搅拌速度为700 r·min-1，水滴加速度为4 mL·min-1)。木质素原料为粒径几微米到几十微米的不规则块状结构(图6A)，LHNPs为表面有单一开口的中空球形，TEM显示球体内部与壳体具有明显反差，进一步证明中空腔体的存在(图6B)。包载DOX后，LHNPs结构未发生改变，DOX被包载在纳米球空腔内部，干燥后结晶成小块状结构(图6C)。与LHNPs红外光谱相比，DOX@LHNPs上出现DOX特征峰(1 622 cm- 1，1 590 cm-1)(图6D)，说明LHNPs成功包载了DOX。除此之外，未发现新的吸收峰，也没有旧的化学键消失，说明DOX通过物理作用包埋在LHNPs内。木质素基中空纳米球在水中的吸收峰为284 nm，而在THF中重新溶解后吸收峰红移到280 nm(图6E)，表明纳米球制备过程中木质素分子之间存在π-π相互作用。谱图显示，在去离子水和THF中重新溶解的纳米球悬浮液分别在290 nm和282 nm处显示吸收峰(图6E)。此外，在482 nm处观察到DOX的吸收峰。载药纳米球相对应的吸收峰红移不同于未载药纳米球，证实载药纳米球在自组装制备过程中木质素与阿霉素分子之间存在π-π相互作用。图7为DOX的TEM和XRD，进一步证明载药LHNPs腔体内的块状物质为DOX的结晶体。

图6 EHL(A)、LHNPs(B)和DOX @LHNPs(C)的SEM(插图为对应的TEM)以及LHNPs、DOX @LHNPs的红外光谱和紫外可见光光谱(E)Fig.6 SEM images of EHL(A), LHNPs(B)and LHNPs@DOX(C)(the inset is the corresponding TEM images)，FTIR (D) and UV-Vis absorption spectra(E) of LHNPs and LHNPs@DOX

图7 DOX干燥后的TEM(A)和XRD(B)Fig.7 TEM image(A) and XRD pattern(B)of DOX after drying

3 讨论

木质素是一种广泛存在于植物体内的无定形芳香性高聚物，分子结构中含有苯环、甲氧基、酚羟基等结构单元。作为两亲性聚合物，木质素分子链上同时含有疏水和亲水性基团，可以在选择性溶剂中发生微观相分离并自组装成具有疏溶剂性核和溶剂化壳的聚集体(Hongetal.， 2016)，其形成疏溶剂微区的推动力主要有π-π作用、亲疏水作用、氢键作用、溶剂效应等(Hongetal.， 2015)。酶解木质素作为一种生物质炼制的副产品，因良好的生物降解性、生物相容性、pH和热稳定性等特性，已成为药物控释领域具有广阔应用前景的原料。

纳米木质素中空球形材料具有较大的比表面积和内部空间、较低的密度以及良好的稳定性和渗透性，粒子结构的控制对其在多种领域的选择应用具有重要意义。纳米木质素中空粒子自组装制备过程中，控制结构的因素主要有木质素初始质量浓度、转速和去离子水滴加速度，其中木质素初始质量浓度对粒子结构的影响更显著。通过控制初始质量浓度制备不同结构的纳米木质素粒子，能够为不同领域的选择利用有针对性地提供所需的粒子结构。

DOX@LHNPs药物释放试验结果表明，相比自由DOX，LHNPs对药物具有较好的控释行为。酸性(pH5.5)条件下，DOX@ LHNPs释放DOX的速度大于中性(pH7.4)条件下的药物释放速度，因此当DOX@ LHNPs进入细胞后，溶酶体的酸性环境会促进DOX的释放，达到更好的治疗效果(Yuetal.， 2014)。

4 结论

1) 酶解木质素可在四氢呋喃中发生微观相分离，并自组装成尺寸稳定且表面具有单孔的中空球形纳米粒子，能够在水中稳定保存10天以上。

2) 通过控制酶解木质素初始质量浓度，可调控中空纳米粒子的直径和壳层壁厚。初始质量浓度低时，制备的木质素球直径较大，壳层较薄，比表面积和孔隙率较大。

3) LHNPs的比表面积和孔隙率越大，其载药量越大，但结构更规整、壳层壁更厚的纳米中空载药粒子对DOX的释放更稳定。