分光光度法测定饲料中总磷含量的不确定度研究

任 丽,王 佳，马文丽，宋晓东

(内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 011500)

本研究根据GB/T 6437—2018《饲料中总磷的测定 分光光度法》，结合JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，对测定结果进行不确定度进行分析评定，找出检测结果的主要影响因素，为评定分光光度法测定饲料中总磷含量的不确定光度提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

分光光度计，日立U-1900;磷酸二氢钾;磷标准储备液50 μg/ml。

1.2 检测方法

依据GB/T 6437—2018《饲料中总磷的测定 分光光度法》测定。

1.3 样品前处理及测定

1.3.1样品前处理

称取2.0～5.0 g试样，置于坩埚中，在电热板上小心碳化，再放入高温炉，在550℃灼烧3 h，取出冷却，加盐酸溶液10 ml，硝酸数滴，小心煮沸10 min，冷却后用水转入100 ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，为试样溶液。

1.3.2绘制标准曲线

准确移取磷标准储备液0、1、2、5、10、15 ml(0、50、100、250、500、750 μg)于50 ml容量瓶中，分别加入10 ml钒钼酸铵显色剂，用水稀释至刻度，摇匀，常温放置10 min以上，以0 ml磷标准溶液为参比，用1 cm比色皿，在400 nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线。

1.3.3样品测定步骤

准确吸取1.00～10.0 ml试样溶液(含磷量为50～750 μg)于50 ml容量瓶中，加入10 ml钒钼酸铵显色剂，用水稀释至刻度，摇匀，常温放置10 min以上，用1 cm比色皿，在400 nm波长下用分光光度计测定试样溶液的吸光度，通过工作曲线计算试样溶液的磷含量(同时做空白)，若试样溶液浓度超过工作曲线范围，样液应进行稀释。

2 结果与讨论

2.1 被测样品的数学模型

(1)

式中,y为试样中磷的含量；m为试样质量，g；m1为通过工作曲线计算出试样溶液中磷的含量，μg；V为试样溶液的总体积，ml；V1为试样测定时移取试样溶液的体积，ml；106为换算系数。

2.2 实验过程使用的仪器设备、计量器具、标准物质的相关信息

1 ml分度吸量管A级，最大容量允差±0.008 ml；2 ml分度吸量管A级，最大容量允差±0.012 ml；5 ml分度吸量管A级，最大容量允差±0.025 ml；10 ml分度吸量管A级，最大容量允差±0.05 ml；50 ml单标线容量瓶A级，最大容量允差±0.02 ml；100 ml单标线容量瓶A级，最大容量允差±0.08 ml；电子天平，0～210 g，最大允差为±0.000 2 g；分光光度计，波长准确度1.8 nm。

磷标准物质，相对扩展不确定度(k=2)为0.5%。

2.3 测量结果计算

对同一饲料样品重复测量2次，分别将每次测出的样品质量、通过工作曲线计算出的试样溶液中磷含量、试样总体积、试样测定时移取试样溶液的体积代入公式(1)，具体数据及结果见表1。

表1 测量数据

2.4 不确定度分量的识别、分析、量化

按照“2.1被测样品的数学模型”，不确定度来源有5个：

①总重复性u(r)；

②质量m的标准不确定度u(m);

③移取体积V1的标准不确定度u(V1);

④定容体积V的标准不确定度u(V);

⑤通过工作曲线计算出试样溶液中磷的含量m1的标准不确定度u(m1)。

2.4.1总重复性u(r)

在重复性条件下，对同一试样从取样开始重复测量10次，用贝塞尔公式计算该测量列的实验标准差s。

总重复性u(r)为测量结果y的标准差。典型的重复性数据见表2。

表2 重复性数据

2.4.2质量m的标准不确定度u(m)

证书提供的精密天平线性误差为±0.000 2 g，矩形分布，k=31/2，

2.4.3体积V1的标准不确定度u(V1)

包括刻度管校准u1(V1)、温度影响u2(V1)2项。

2.4.3.1刻度管校准不确定度u1(V1)

5 ml刻度管的最大允许误差±0.025 ml，服从三角分布，k=61/2。

标准不确定度分量：

2.4.3.2温度影响不确定度u2(V1)

2.4.3.3体积V1的标准不确定度分量u(V1)

u(V1)=(u12+u22)1/2

=(0.010 22+0.003 032)1/2

=0.010 6 ml；

2.4.4体积V的标准不确定度u(V)

包括容量瓶校准u1(V)和温度影响u2(V)两项。

2.4.4.1校准不确定度u1(V)

2.4.4.2温度影响不确定度u2(V)

定容时容量瓶及溶液的温度与校准时的温度(20 ℃)不同。与液体相比，容量瓶的体积膨胀可忽略。实验室全年温度只能控制在20±5℃，矩形分布，k=31/2；水的体积膨胀系数为2.1×10-4ml/℃。

2.4.4.3体积V的标准不确定度分量u(V)

u(V)=(u12+u22)1/2=(0.032 62+0.060 62)1/2=0.063 9 ml；

2.4.5试样溶液中磷的含量m1的标准不确定度u(m1)

检测样液在工作曲线所读的浓度值的不确定度，由标准溶液的不确定度和曲线拟合的不确定度组成。

2.4.5.1标准溶液

2.4.5.1.1标准物质引入的不确定度

根据国家标准物质中心提供的数据，磷标准品的相对扩展不确定度(k=2)为0.5%。故由磷标准品引入的相对不确定度:

2.4.5.1.2称量过程

天平的最大允许误差为±0.000 2 g。最大容许误差包括了天平校准、称量变动性引起的最大允许误差。按照均匀分布计算，则

天平重复称量由天平引起的相对不确定度为：

2.4.5.1.3稀释过程

稀释过程中需要6个50 ml容量瓶，1个10 ml分度吸量管，1个5 ml分度吸量管，1个2 ml分度吸量管，1个1 ml分度吸量管。

玻璃量具容量允差引起的不确定度见表3；温度变化引起的不确定度见表4。

表3 玻璃量具容量允差引起的不确定度

表4 温度变化引起的不确定度

由表中数据计算标准工作液稀释体积的相对不确定度如下：

2.4.5.2曲线拟合[4-5]

制备好的磷标准溶液c，每个浓度用分光光度计测定2次，得到相应的吸光度A，用最小二乘法拟合，获得直线方程A=a+b×c，线性相关系数r，列于见表5。

表5 磷标准溶液浓度c和吸光度A以及最小二乘法拟合直线方程

对样品测定液进行了10次测定，由直线方程求得平均浓度为：cx=452.901 μg/ml。

标准曲线拟合带来的标准不确定度公式如下：

式中，b为斜率；a为截距;P为样品测试次数；N为测试工作曲线的次数；Cx为样品溶液中磷的含量,μg；Cs为不同浓度标准工作溶液的平均值,μg；Ci为标准工作液的浓度,μg；Ai为与标液Ci对应的吸光值；i为获得标准曲线的测量顺序号。

表6 残差标准偏差计算表

表7 离均差平方和计算表

经计算得出：u(curve)=2.04 μg。

2.4.5.3试样溶液中磷的浓度c的不确定度

=0.007 4

2.5 计算合成标准不确定度ux(y)

2.5.1计算相对合成标准不确定度ucrel(y)

ucrel(y)= [urel2(r)2+urel2(m) +urel2(V1)+urel2(V)+urel2(m1)]1/2=[0.001 12+0.000 0402+0.002 12+0.000 642+0.007 42]1/2=0.010。

2.5.2计算合成标准不确定度uc(y)

uc(y)=ucrel(y)×y=0.010×0.30%

=0.003 0%。

2.6 计算y的扩展不确定度U(y)

取包含因子k=2，扩展不确定度为：

U(y)=k×uc(y)= 2×0.0030=0.01%。

2.7 结果表示

用分光光度法测定饲料中的总磷含量，平行测定2次，取其平均值报告结果，则被测饲料的磷含量y=0.30%，扩展不确定度：

U(y)=0.01 %(k=2)。

3 结论

通过对分光光度法测定饲料中总磷含量的不确定度来源进行分析，并评定各个不确定度分量，得出该分析方法的扩展不确定度为0.01%,包含因子k=2;同时可以得出,采用分光光度法测定饲料中总磷含量的不确定度来源主要是总重复性和通过工作曲线计算出试样溶液中磷的含量m1的标准不确定度u(m1)[7]，而质量m的标准不确定度u(m)、移取体积V1的标准不确定度u(V1)、定容体积V的标准不确定度u(V)对导致的不确定度几乎不影响。

从不确定度结果得出，采用对分光光度法测定饲料中总磷含量保证实验具有良好的重复性[4-6]，准确配制标准品和绘制标准曲线，严格控制实验反应条件，这样对于提高检测的准确性和可靠性具有重要意义。