真空浸渍辅助曲酸对鲜切马铃薯多酚氧化酶和过氧化物酶活性的抑制作用

张 琪，额日赫木，王梦茹，张 芳，宋小青，郜 刚

(山西师范大学食品科学学院，山西 临汾 041004)

马铃薯(Solanumtuberosum，L)是世界上四大粮食作物之一，富含碳水化合物、蛋白质、矿物质、维生素等多种营养素，深受消费者和食品企业的青睐[1]。马铃薯在鲜切过程中极易发生酶促褐变，导致其感官品质和营养价值大幅降低[2]。研究表明，PPO是鲜切马铃薯发生酶促褐变最主要的酶类，它可以催化酚类底物产生有色醌，醌再进一步聚合形成黑色素物质[3-4]。此外，POD在有H2O2存在时，也可通过催化酚类底物发生氧化，形成褐色产物[5]。因此，控制PPO和POD活性对保证鲜切马铃薯品质意义重大。

化学护色剂是鲜切果蔬护色处理的主要方法之一，常用的护色剂有柠檬酸[6-7]、半胱氨酸[8]、酸性硫酸钠[9]、抗坏血酸衍生物[10]等。曲酸作为一种安全无毒的天然护色剂，在抑制鲜切果蔬PPO、POD活性方面具有显著效果[11]。它通过与底物的竞争性抑制、螯合酶活性中心铜离子和还原醌类化合物等多机制共同作用来抑制酶促褐变的发生。Shah等[12]研究表明，在20 d的贮藏期内，采用6 mmol/L的曲酸可以降低荔枝PPO和POD活性，并延缓了其果皮褐变。王擎等[13]以马铃薯和莲藕为材料，研究了不同质量分数曲酸处理的鲜切样品的色泽和相关酶活性在模拟货架期(4℃)内的变化，结果表明，曲酸质量分数分别为0.3%和0.5%时，鲜切马铃薯和莲藕的色泽得到了较好的保护，同时PPO、POD和PAL活性也得到了有效抑制。

近年，物理技术的发展为鲜切果蔬防褐变研究提供了新的思路。如气调保鲜[14]、超声波[15-16]、超高压[17-18]、紫外线[19]等方法都得到了广泛应用。浸渍是食品加工中一种常用的加工方式，它通过渗透作用，将浸渍液中的溶质迁移到食品物料内部。真空浸渍技术(VI)是将真空技术引入到浸渍工艺中的一项新技术，在食品工业中具有广泛的应用基础[20-21]。真空过程中，物料组织间隙内的气体会发生膨胀，并逐渐被排出。浸渍过程中，在压力差驱动下促使外部浸渍液渗透到组织间隙。VI与传统的浸渍工艺相比具有用时短、操作简单和对食品组织结构及营养物质的破坏作用小等优势。如Perez-Cabrera等[22]通过VI与褐变抑制剂结合对梨的防褐变研究发现，经浸渍处理鲜切梨在4℃下可保存20 d，且样品的褐变程度较小。表明VI可与褐变抑制剂相结合用于果蔬防褐变处理,但此方法应用于马铃薯的的研究还未有报道。故本研究以鲜切马铃薯为对象，拟采用VI辅助曲酸抑制其PPO和POD活性。首先通过单因素试验考察VI条件对PPO和POD活性的抑制效果；在此基础上，分别以PPO和POD活性为评价指标，采用Box-Behnken试验设计和响应面(RSM)分析方法确定最佳VI工艺条件，以期为抑制鲜切马铃薯在加工和贮藏过程中的褐变提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

克新1号马铃薯，市售，产自内蒙古；邻苯二酚，分析纯，南京化学试剂股份有限公司；曲酸，食品级，广东味多美食品配料有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，均为分析纯，天津市光复科技发展有限公司；愈创木酚，分析纯，天津市光复精细化工研究所；过氧化氢 30%，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；无水乙醇，分析纯，天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

PC-3塑料真空干燥器，上海越磁电子科技有限公司；2XZ-1真空泵，上海万经泵业制造有限公司；752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；H1805R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LC-Q01切片机，佛山市顺德区韩泰电器有限公司；PHS-25数显pH计，上海化科实验器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1试料褐变抑制处理方法

马铃薯经过清洗、去皮，切片(0.3 cm)，置于含有300 ml曲酸溶液的烧杯中，再将其置于VI装置内进行处理。VI装置主要由真空泵和密闭容器(双阀门PC干燥器)组成，系统恒定的真空度约为15.11×10-3mPa。真空处理：启动真空泵，密闭容器中样品和浸渍液的空气被逐渐排出。浸渍处理：关闭真空泵，打开密闭容器阀门，使系统恢复大气压状态，曲酸溶液(浸渍液)在压差的驱动下逐渐向样品组织间隙内渗透。

1.3.2粗酶液的提取及PPO和POD活性的测定

参照Tribst等[23]的研究提取粗酶液，稍作改动。将马铃薯片切割成小块，称取5 g样品加入30 ml预冷的磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH6.8,4℃)研磨、过滤，在10 000 r/min、4℃下离心15 min，上清液即为粗酶液，进行PPO和POD活性测定。

PPO活性参照Zhang等[24]的方法进行检测，有改动。分别取2 ml的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH6.8)，1 ml 0.02 mol/L的邻苯二酚，混匀，在30℃下预热5 min，加入1 ml粗酶液，在410 nm处测定其吸光值，每隔30 s记录1次，共记录3 min。一个酶活性单位(U)定义为：测定条件下，每分钟引起吸光值改变0.001所需的酶量(ml)。

，

(1)

式中，EA为酶活性，U/ml；△OD410为反应时间内吸光值的变化；t为反应时间，min；D为稀释倍数。

POD活性参照王礼群等[25]的方法进行检测，有改动。取1 ml愈创木酚、2 ml H2O2和1 ml的磷酸缓冲溶液于试管中，再加入1 ml粗酶液，摇匀，在470 nm处测定吸光值，每隔30 s记录1次，共记录3 min。一个酶活性单位(U)定义为：测定条件下，每分钟引起吸光值改变0.001所需的酶量(ml)。

，

(2)

式中，EA为酶活性，U/ml；△OD470为反应时间内吸光值的变化；t为反应时间，min；D为稀释倍数。

1.4 单因素试验设计

单因素试验中，选择真空时间、浸渍时间、曲酸质量分数作为VI处理的3个主要条件，见表1。

表1 单因素试验设计

按表1设计试验，分别考察3个因素对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响，以此来筛选出最佳VI处理条件。

1.5 RSM优化试验设计

在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0 统计分析软件中Box-Behnken中心组试验设计原理，以真空时间(X1)，浸渍时间(X2)和曲酸质量分数(X3)为自变量，分别以鲜切马铃薯PPO和POD活性为响应值(Y1，Y2)，设计三因素三水平RSM试验。各因素和水平见表2。

表2 响应面实验因素与水平设计

1.6 数据处理

试验数据以“平均值±标准差”的形式表示，单因素试验利用IBM SPSS 20.0软件进行统计分析，采用邓肯氏多重范围比较法进行显著性分析，利用Origin 2018软件进行作图。Design Expert 8.0软件设计响应面试验方案并进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1真空时间对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响

真空时间对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响见图1。

图1 真空时间对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响

如图1所示，随着真空时间的延长，鲜切马铃薯的PPO和POD活性均呈平缓下降趋势。在真空时间为12～15 min时，其PPO和POD活性较低，且无显著性差异(P<0.05)，分别为471.2～476.268 U/ml和126.35～133.632 U/ml。与对照组(0 min)相比，PPO和POD活性分别下降了40.38%和34.05%。随着真空时间的延长，有利于外部曲酸浸渍液向马铃薯内部渗透，从而提高浸渍效率。Hironaka等[26]用10%的抗坏血酸溶液对马铃薯进行VI处理(真空度9.33 kPa，真空时间0～60 min，浸渍时间3 h)，结果表明，随着真空时间的延长，马铃薯块茎抗坏血酸的含量也在逐渐增加，且真空处理60 min时的抗坏血酸含量是普通马铃薯的21倍，说明真空时间的延长有利于更多的浸渍液渗透到原料组织间隙。但延长到一定时间时，物料间隙内的空气被排出，最终达到恒定值，表明此时马铃薯的有效空隙率已达到了最大值[27]，即进入其细胞间隙的曲酸溶液达到了最大值。因此，真空12 min后PPO和POD活性逐渐稳定，且没有出现明显下降趋势。故最佳的真空处理时间为12～15 min。

2.1.2浸渍时间对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响

浸渍时间对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响见图2。

图2 浸渍时间对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响

如图2所示，随着浸渍时间的延长，鲜切马铃薯PPO和POD活性均呈缓慢下降趋势；当浸渍时间为8～10 min时，其PPO和POD活性较低，且无显著性差异(P<0.05)，分别为542.132～561.134 U/ml和133.95～149.784 U/ml。与对照组(0 min)相比，PPO和POD活性分别降低了31.41%和32.21%。浸渍时间是影响浸渍效果的主要因素之一，在压力差的驱动下，物料外部的浸渍液逐渐向物料组织渗透，并经过一定时间后达到饱和(物料内外压力差达到平衡)[27]，而在本研究中，浸渍时间达到8 min时，曲酸溶液的渗透量可能达到了最大值。因此，浸渍8 min后，曲酸溶液的渗透量不再增加，因此鲜切马铃薯PPO和POD活性也不会发生变化。故最佳浸渍时间应为8～10 min。

2.1.3曲酸质量分数对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响

曲酸质量分数对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响见图3。

如图3所示，在曲酸质量分数为0～0.5%时，鲜切马铃薯PPO和POD活性均呈缓慢下降趋势。当增大至0.75%～1.25%时，其PPO和POD活性较低，且无显著性差异(P<0.05)，分别为580.134～604.2 U/ml、127.934～135.218 U/ml。与对照组(0%)相比，PPO和POD活性分别降低了26.72%和29.37%。在VI过程中，如果其他条件恒定时，物料的浸渍效率随着浸渍液质量分数的增加而增加。因此，在曲酸质量分数为0～0.5%时，随着曲酸溶液渗透量的逐渐增加，鲜切马铃薯PPO和POD活性呈下降趋势。但浸渍液浓度过高可能会阻碍溶质向物料组织内的传质，从而降低传质效率[27]，因此曲酸质量分数在0.75%～1.25%时，其在样品组织间隙内的渗透可能达到了饱和，故鲜切马铃薯PPO和POD活性不再变化。所以最佳曲酸质量分数为0.75%～1.25%。

图3 曲酸质量分数对鲜切马铃薯PPO和POD活性的影响

综上所述，在VI辅助作用下，曲酸能够显著抑制鲜切马铃薯PPO、POD活性。随着真空时间、浸渍时间、曲酸质量分数的增加，其PPO、POD活性得到了有效抑制。从节约成本和时间的方面考虑，最佳的VI处理条件分别确定为：真空时间12 min，浸渍时间8 min，曲酸质量分数0.75%。

2.2 响应面分析

2.2.1PPO响应面分析

响应面试验设计方案及结果见表3。

表3 响应面试验设计方案及结果

根据Box-Behnken试验设计方案及ANOVA分析方法进行二次回归分析，得到各因素变量与响应值Y1的回归方程为：

Y1=408.76+4.26X1+43.63X2-31.96X3+

33.85X1X2+33.67X1X3-7.09X2X3+

80.59X12+11.17X22+66.32X32。

对回归方程进行方差分析，结果见表4。

表4 回归方程系数及显著性检验

注：* 表示差异显著，P< 0.05；**表示差异极显著，P< 0.01；— 表示差异不显著。

等高线的形状反应了各因素之间交互效应的大小，圆形表示两因素交互作用不明显，椭圆形表示交互作用显著。如图4所示，当浸渍时间不变时，随着真空时间的增加，PPO活性先下降后上升；当真空时间不变时，随着浸渍时间的增加，PPO活性保持上升，变化较为缓慢。由图5可知，当浸渍时间不变时(8 min)，真空时间和曲酸质量分数的交互作用较为显著。当真空时间不变时，PPO活性随着曲酸质量分数的增加先下降后上升。反之也有同样的规律。如图6所示，当浸渍时间不变，随着曲酸质量分数的增加，PPO活性先下降再上升，但变化程度都相对比较平缓，说明浸渍时间和曲酸质量分数的交互作用对鲜切马铃薯PPO活性作用不大。

图4 真空时间和浸渍时间对鲜切马铃薯PPO活性的作用图

图5 真空时间和曲酸质量分数对鲜切马铃薯PPO活性的作用图

图6 浸渍时间和曲酸质量分数对鲜切马铃薯PPO活性的作用图

通过回归模型进行数学分析，得到抑制鲜切马铃薯PPO活性的最佳VI条件：真空时间为11.70 min，浸渍时间为7.40 min，曲酸质量分数为0.76%。在此条件下，PPO的理论预测值为403.369 U/ml。综合实际条件，适当改变理论条件：真空时间为12 min，浸渍时间为7.5 min，曲酸质量分数为0.76%。采用VI条件进行验证试验，得到的实际PPO活性为412.26 U/ml，与理论值比较，相对误差在2.2%左右，证明理论值和实际值的拟合较好。因此采用RSM优化得到的VI条件，在实际应用中是可行的。

2.2.2POD响应面分析

试验结果如表5所示，根据Box-Behnken试验设计方案及ANOVA分析方法进行二次回归分析，得到各因素变量与响应值Y2的回归方程为：

Y2=97.53-10.67X1+6.65X2+1.75X3-

10.00X1X2-9.21X1X3-3.54X2X3+

28.59X12+10.30X22+14.75X32。

对回归方程进行方差分析，结果见表6。

表5 响应面试验设计方案及结果

表6 回归方程系数及显著性检验

注：*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01；—表示差异不显著。

如图7所示，当曲酸质量分数不变时(0.75%)，真空时间与浸渍时间的交互作用明显。当真空时间一定时，随着浸渍时间的增加，POD活性先下降后上升。反之，当浸渍时间一定时，随着真空时间的增加，POD活性先降低后上升。图8表示当浸渍时间为8 min时，真空时间和曲酸质量分数对POD活性的影响。真空时间不变时，POD活性随着曲酸质量分数的增加先下降后上升。反之也有同样的规律。当真空时间为12 min时，浸渍时间和曲酸质量分数的交互作用见图9，此时POD活性随着两个因素值的增加而缓慢降低，达到最小值以后又缓慢上升。

图7 真空时间和浸渍时间对鲜切马铃薯POD活性的作用图

图8 真空时间和曲酸质量分数对鲜切马铃薯POD活性的作用图

图9 浸渍时间和曲酸质量分数对鲜切马铃薯POD活性的作用图

通过回归模型进行数学分析，得到抑制鲜切马铃薯POD活性的最佳VI条件：真空时间为12.26 min，浸渍时间为7.73 min，曲酸质量分数为0.75%。在此条件下，POD的理论预测值为95.898 U/ml。综合实际条件，适当改变理论条件：真空时间为12 min，浸渍时间为8 min，曲酸质量分数为0.75%。采用VI条件进行验证试验，得到的实际POD活性为97.75 U/ml，与理论值比较，相对误差在1.93%左右，证明理论值和实际值的拟合较好。因此采用RSM优化得到的VI条件在实际应用中是可行的。

3 结论

根据单因素试验和响应面试验对鲜切马铃薯PPO和POD活性的抑制条件进行研究，考察了真空时间、浸渍时间和曲酸质量分数对鲜切马铃薯PPO和POD活性的交互作用。结果表明：真空时间、浸渍时间、曲酸质量分数对鲜切马铃薯PPO活性均有着显著影响，各因素对PPO影响次序为：浸渍时间>曲酸质量分数>真空时间对POD影响次序为：真空时间>浸渍时间>曲酸质量分数。选取PPO的最佳VI条件参数为：真空时间为12 min，浸渍时间为7.5 min，曲酸质量分数为0.76%；POD的最佳VI条件参数为：真空时间为12 min，浸渍时间为8 min，曲酸质量分数为0.75%。结合验证试验的结果，说明本试验研究的最佳条件参数有实际参考价值。