三叶青提取物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响及作用机制研究

黄慧伟 杜蔚连 邓茜

宫颈癌作为妇科常见肿瘤之一，近年来发病率已经排在女性恶性肿瘤第2位[1]。由于肿瘤放疗、化疗带来的毒副反应较强，从天然植物中筛选抗肿瘤药物已成为热门研究方向。三叶青主要产于我国浙江、福建、江苏等少数地区，现有研究发现其能有效治疗肝炎、缓解风湿性关节炎症状，还可用于肿瘤治疗[2]。有研究指出，三叶青具有细胞毒性，能诱导细胞凋亡，从而有效抑制肺癌、结肠癌等多种体外培养肿瘤细胞的增殖[3-4]。基于此，本研究以三叶青提取物作用于体外培养的宫颈癌HeLa细胞，分析其对宫颈癌细胞增殖的影响，并探讨其作用机制，以期为临床应用提供参考，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 三叶青提取物制备 三叶青块根购自宁波圣旺生物科技有限公司，取1kg采用醇提、酸沉淀的方法[4]得三叶青提取物8g。

1.1.2 主要仪器和试剂 细胞培养箱（中国香港Hecnforce公司）；高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；酶标仪、电泳仪、蛋白成像系统（美国BIO-RAD公司）；流式细胞仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。MTT溶液、0.25%胰蛋白酶、Annexin V-FITC、PI（北京Solarbio公司）。

1.1.3 细胞培养 取冷冻保存的人宫颈癌HeLa细胞株于37℃水浴中快速解冻，细胞培养液采用10%胎牛血清加RPMI 1640培养液。细胞培养条件：37℃、5%二氧化碳恒温、恒湿细胞培养箱，48h换取新鲜培养液，显微镜下观察细胞铺满瓶底80%时进行传代。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖实验 采用MTT法检测三叶青提取物对HeLa细胞增殖的影响。取对数生长期的HeLa细胞，以5×104/ml的浓度接种于96孔板，每孔0.1ml；待细胞贴壁后，将细胞分为5组，分别加入三叶青提取物，使其终浓度分别为 0（对照组）、1、2、4、8mg/ml，培养 24 或48h后，每孔加入20μl MTT溶液，继续培养4h，最后每孔加入100μl DMSO溶液，15min后于570nm波长下测OD值，每个浓度设置6个复孔。细胞抑制率（%）=（1-药物组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.2 细胞形态学观察 以0.25%胰蛋白酶将对数生长期的HeLa细胞消化后接种于6孔板，每孔5×106个细胞。待细胞贴壁后，细胞分组及三叶青提取物干预方式同上。48h后于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.2.3 细胞凋亡实验 将对数生长期的HeLa细胞以每孔5×106个加入6孔板中，细胞分组及三叶青提取物干预方式同上。48h后，离心收集细胞，PBS缓冲液清洗细胞3次，收集的细胞以500μl结合PBS缓冲液重悬，最后用5μl Annexin V-FITC和10μl PI进行染色，常温下避光反应15min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 细胞相关蛋白表达检测 采用Western blot法检测HeLa细胞迁移相关蛋白基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9，细胞凋亡相关蛋白p53、Bax的表达情况。细胞分组及三叶青提取物干预方式同上。细胞分组处理48h后收集细胞，细胞裂解液裂解细胞，收集总蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度。以SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜、以5%脱脂奶粉封闭1h、加入一抗（4℃摇床孵育过夜）；PBST洗涤后，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，最后加入显影液，上机拍照，并进行灰度值分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三叶青提取物对HeLa细胞增殖的影响 与对照组相比，随着三叶青提取物浓度的增加，HeLa细胞OD值呈逐渐下降趋势。三叶青提取物处理24h后，除1mg/ml组与对照组无统计学差异外（OD值比较P＞0.05），其余各组均对HeLa细胞的增殖表现出抑制效应（各组OD值比较均P＜0.05），且随着浓度的增加，抑制效应逐渐增强；而三叶青提取物处理48h后，各组OD值均出现下降（均P＜0.05），且具有浓度依赖效应，见表1。

2.2 三叶青提取物对HeLa细胞形态的影响 显微镜下显示，三叶青提取物处理48h后的HeLa细胞形态逐渐由长梭形或纺锤形变为椭圆形，细胞伪足变短，细胞间隙增宽；且随着三叶青提取物浓度的增加，镜下凋亡细胞开始增多，细胞碎片增加，见图1。

2.3 三叶青提取物对HeLa细胞凋亡的影响 V-FITC/PI双染流式细胞术显示，与对照组相比，除1mg/ml组无统计学差异（P＞0.05）外，其余各组凋亡细胞数均明显增加（均P＜0.05），且呈现浓度依赖性，见图2。

2.4 三叶青提取物对HeLa细胞相关蛋白表达的影响 与对照组相比，其余各组HeLa细胞MMP-2及MMP-9蛋白表达水平均呈现下降趋势（均P＜0.05），且MMP-2表达水平与三叶青提取物呈浓度依赖性；而p53与Bax蛋白表达水平与对照组相比均明显升高（均P＜0.05），且随着三叶青提取物浓度增加，p53与Bax蛋白表达水平逐渐上升，当三叶青提取物浓度达到8mg/ml时，由于细胞凋亡数量过多，导致该两类蛋白表达水平出现下降。见图3。

表1 三叶青提取物对HeLa细胞增殖的影响

图1 HeLa细胞不同浓度三叶青提取物处理48h后的形态（×400）

图2 HeLa细胞不同浓度三叶青提取物处理48h后流式细胞图及凋亡率

3 讨论

目前关于三叶青在抗呼吸系统[5]、消化系统[6]等肿瘤作用方面的研究已展开较多，但对抗宫颈癌的作用及其作用机制的研究却鲜有报道。本研究结果显示，三叶青提取物对人宫颈癌HeLa细胞表现出一定的增殖抑制作用：与三叶青提取物共培养24h后，2mg/ml组即表现出细胞增殖抑制作用（12.7%）；共培养48h后，1mg/ml组也表现出细胞增殖抑制作用（5.7%），且最高剂量8mg/ml组细胞抑制率达到47.2%。由此可见三叶青提取物对HeLa细胞具有较强的细胞毒性。而细胞形态学观察及流式细胞术结果也显示，随着三叶青提取物浓度的增加，HeLa细胞随即出现明显的凋亡特征：细胞质浓缩，变小、细胞核固缩、细胞裂片形成，当药物浓度达到8mg/ml时，细胞凋亡率达37%，可见三叶青提取物可明显促进HeLa细胞凋亡进程。

图3 HeLa细胞不同浓度三叶青提取物处理48h后相关蛋白表达电泳图和水平比较

细胞凋亡属于程序化进程，影响细胞凋亡的因子很多。人体p53基因具有抑制肿瘤发生的作用[7]，p53基因在细胞内发生氧化应激、DNA损伤修复、营养缺乏和其他癌基因被激活等情况下可被激活[8]。p53蛋白可通过正向调节Bax等凋亡相关蛋白的合成，引起细胞凋亡[9-10]。郑倩等[11]以β-氧化石竹烯作用于HeLa细胞，结果显示β-氧化石竹烯能促进细胞p53蛋白上调诱导细胞凋亡。本研究结果显示，三叶青提取物可促进HeLa细胞p53蛋白上调，并进一步上调凋亡蛋白Bax的合成，提示三叶青提取物通过该信号通路促进HeLa细胞凋亡。

癌细胞浸润是癌症扩散的病理生理基础，而癌细胞突破细胞外基质是浸润的重要过程。基质金属蛋白酶作为一类离子通道依赖型细胞外基质降解酶，可以促进细胞外基质降解，协助癌细胞转移[12]。MMP-2与MMP-9高表达与癌细胞迁移能力成正相关[13-14]。姚昭等[15]发现，有机硒作用后的大肠癌Lovo细胞MMP-2与MMP-9表达水平明显下降，且细胞迁移能力减弱。本研究结果也显示，三叶青提取物能有效降低HeLa细胞中MMP-2、MMP-9表达水平，且具有药物浓度依赖性。这提示三叶青提取物可能通过该途径抑制HeLa细胞侵袭和迁移。

综上所述，三叶青提取物对宫颈癌HeLa细胞增殖起抑制作用。其或通过上调p53及Bax蛋白表达诱导HeLa细胞凋亡，且具有浓度依赖性；通过下调MMP-2及MMP-9表达影响HeLa细胞侵袭和迁移。