固态发酵棉籽仁的营养成分及其抗氧化活性

李园成，孙 宏，吴逸飞，姚晓红，沈 琦，汤江武

(浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021)

我国作为产棉大国，每年产生的棉籽数量巨大。棉籽脱壳后的棉籽仁中蛋白质含量约为40%，粗脂肪约占28%。此外，棉籽仁还富含B族维生素和有机磷等，是优良的动物饲料资源[1-2]。但其营养品质不均衡，且含有棉酚等有毒物质，这极大地限制了棉籽仁的饲料化应用，易造成资源浪费[3-4]。

微生物固态发酵是改善饲料原料品质的有效手段[5]。研究发现，采用微生物固态发酵能改善棉籽粕[6]、豆粕[7]等植物蛋白原料的品质，可有效减少或去除发酵底物中的抗营养因子。同时，发酵底物中存留有许多酶类和促生长因子，能改善动物的肠道健康[7-9]。但目前相关研究主要集中在棉籽粕的脱毒和品质改良上[10-12]，以棉籽仁为直接研究对象的报道还较少。考虑到棉籽仁的营养成分中含有较高的脂肪含量，若能直接使用，可同时提供蛋白和能量，特采用酵母菌、芽孢杆菌对棉籽仁进行混合固态发酵，研究发酵前后其营养成分和抗氧化活性的变化，以期为增强棉籽仁的营养价值提供新的实现途径，也为发酵棉籽仁的推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Yn和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B1均为本实验室保藏菌种。

1.1.2 试验原料和试剂

棉籽仁购自新疆泰昆集团公司，含水率11.6%，粗蛋白含量40.9%，游离棉酚含量9 160 mg·kg-1，粗脂肪含量27.4%。

二丁基羟基甲苯(BHT)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，购自Sigma公司；菲洛嗪、乙二胺四乙酸(EDTA)、3-氨基-1-丙醇、铁氰化钾、维生素C(VC)均购自国药集团上海化学试剂有限公司。其余试剂为国产分析纯。

1.1.3 培养基

芽孢杆菌B1的培养基为LB培养基；酵母菌Yn采用YPD培养基，参照胡永娜等[8]的方法配置。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵种子液制备

参照孙宏等[13]的方法制备种子液。取芽孢杆菌B1和酵母菌Yn斜面各刮取一环分别接种于装有20 mL LB和YPD液体培养基的50 mL三角瓶中，于30 ℃、180 r·min-1条件下分别摇床培养18 h和24 h，取出备用。

1.2.2 发酵棉籽仁制备

取棉籽仁100 g于500 mL广口瓶中，料水比1∶0.45搅拌均匀，于115 ℃处理25 min，取出放凉后分别接种1%(体积质量比)的B1种子液和1.5%(体积质量比)的Yn种子液，菌体终浓度分别是8×106CFU·g-1和2×106g-1，自然pH条件下混合均匀后放置于30 ℃培养箱发酵30 h，其间翻料2次，同时在24、30 h取样，-20 ℃保存备用。发酵完毕后，于50 ℃烘至恒重，粉碎过60目筛待测。

1.2.3 发酵棉籽仁中棉籽肽的提取与制备

参照He等[14]的方法提取发酵后棉籽仁中的棉籽肽。取5 g发酵棉籽仁样品于100 mL离心管中，加入75 mL去离子水，置于摇床上振荡提取30 min，经离心、真空过滤、超滤、脱盐，及真空冷冻干燥，得到棉籽肽粗提物(以下简称为棉籽肽)，于-20 ℃保存备用。

1.2.4 常规营养成分分析测定

粗蛋白含量采用凯氏定氮法，参照GB/T 5009.5—2003测定；灰分含量参照GB 5009.4—2010测定；粗脂肪含量采用索氏提取法，参照GB/T 14772—2008测定；酸溶蛋白质含量采用福林酚法测定；氨基酸含量由华测检测技术有限公司检测。

1.2.5 抗氧化活性测定

将棉籽肽配制成质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0 mg·mL-1的溶液，参照Ajibola等[15]的方法测定羟自由基清除能力，参照孙宏[16]的方法测定总还原能力，参照Zhang等[17]的方法测定DPPH自由基清除能力，参照Foh等[18]的方法测定金属离子螯合能力。

1.3 统计分析

数据采用SPSS 19.0软件进行方差分析，对有显著(P<0.05)差异的，组间进行T检测。

2 结果与分析

2.1 发酵前后棉籽仁的营养成分变化

2.1.1 常规营养成分

由表1可知，发酵棉籽仁相比发酵前游离棉酚含量显著(P<0.05)降低，粗灰分和酸溶蛋白质含量显著(P<0.05)提高，粗蛋白、粗纤维和粗脂肪含量无显著变化。

表1 发酵前后棉籽仁的营养成分组成(风干基础)

Table 1 Composition of cottonseed kernel before and after fermentation (air drying basis)

营养成分Nutrient发酵前Beforefermentation发酵后Afterfermentation 粗蛋白Crude protein/%40.9±0.141.7±0.1粗纤维Crude fiber/%3.9±0.34.8±0.1粗脂肪Crude fat/%27.4±0.127.5±0.4粗灰分Crude ash∗/%3.7±0.15.5±0.1游离棉酚Free gossypol∗/(mg·kg-1)9 160±208373±41酸溶蛋白质Acid soluble protein∗/%2.23±0.106.92±0.15

标*的表示该成分在发酵前后差异显著(P<0.05)。下同。

Item marked with * indicated significant (P<0.05) difference before and after fermentation. The same as below.

2.1.2 氨基酸含量

由表2可知，发酵后的棉籽仁仅精氨酸含量显著降低(P<0.05)，其他氨基酸及总氨基酸含量均无显著变化。

2.2 棉籽肽的抗氧化活性

2.2.1 羟自由基清除能力

由图1可知，不同处理时间(24、30 h)下，棉籽肽的羟自由基清除能力均随着浓度增加而升高，其中，从发酵30 h的棉籽仁中提取的棉籽肽羟自由基清除率最高，达到(61.71 ± 1.59)%。

表2 发酵前后棉籽仁的氨基酸含量 %

Table 2 Amino acid content of cottonseed kernel before and after fermentation

氨基酸Amino acid发酵前Before fermentation发酵后After fermentation 天冬氨酸Asp3.63 ± 0.053.57 ± 0.03苏氨酸Thr1.26 ± 0.031.34 ± 0.01丝氨酸Ser1.70 ± 0.021.70 ± 0.01谷氨酸Glu7.63 ± 0.117.61 ± 0.03甘氨酸Gly1.63 ± 0.031.62± 0.01丙氨酸Ala1.52 ± 0.031.54 ± 0.01胱氨酸Cys0.63 ± 0.020.63 ± 0.02缬氨酸Val1.53 ± 0.021.63 ± 0.01蛋氨酸Met0.39 ± 0.020.43 ± 0.01异亮氨酸Ile1.21 ± 0.021.29 ± 0.01亮氨酸Leu2.34 ± 0.042.41 ± 0.02酪氨酸Tyr1.09 ± 0.031.21 ± 0.02苯丙氨酸Phe2.10 ± 0.022.20 ± 0.01赖氨酸Lys1.80 ± 0.041.83 ± 0.01组氨酸His1.11 ± 0.021.12 ± 0.01精氨酸Arg∗4.70 ± 0.063.91 ± 0.03脯氨酸Pro1.48 ± 0.021.55 ± 0.03总氨基酸Total amino acids35.76 ± 0.4635.90 ± 0.18

图1 不同发酵时间棉籽肽质量浓度对其羟自由基清除率的影响Fig.1 Effect of concentration of cottonseed peptide extracted with different fermentation time on hydroxyl scavenging rate

2.2.2 DPPH自由基清除能力

由图2可知，棉籽肽对DPPH自由基的清除能力随着其质量浓度的提高而上升。当棉籽肽的质量浓度为8 mg·mL-1时，24 h和30 h所提取的棉籽肽的DPPH自由基清除率分别达到最大值，分别为(65.37 ±1.87)%和(77.25±1.28)%。

2.2.3 金属离子螯合能力

由图3可知，棉籽肽的金属离子螯合能力随着其质量浓度的增加而升高，其中，发酵30 h的棉籽肽，当其质量浓度为8 mg·mL-1时，对金属离子的螯合能力最高，可达到(79.13±0.55)%。

图2 不同发酵时间棉籽肽质量浓度对其DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of concentration of cottonseed peptide extracted with different fermentation time on DPPH scavenging rate

2.2.4 总还原能力

由图4可知，发酵30 h的棉籽肽，当其质量浓度为8 mg·mL-1时，总还原能力最强，达到(0.69±0.02)。

图3 不同发酵时间棉籽肽质量浓度对其金属离子螯合能力的影响Fig.3 Effect of concentration of cottonseed peptide extracted with different fermentation time on metal chelating ability

图4 不同发酵时间棉籽肽质量浓度对其总还原能力的影响Fig.4 Effect of concentration of cottonseed peptide extracted with different fermentation time on reducing power

3 讨论

本研究表明，酿酒酵母Yn和枯草芽孢杆菌B1发酵处理，可显著降低棉籽仁中游离棉酚的含量，降低其毒性，提高酸溶蛋白质含量，改善棉籽仁的营养品质。从中提取的棉籽肽具有较好的抗氧化活性，饲料应用前景广阔。

本研究发现，发酵后棉籽仁的游离棉酚含量较发酵前显著降低。这与朱德伟等[2]的研究结果一致。游离棉酚含量的降低主要由发酵前原料的灭菌热脱毒，及微生物发酵过程中的生物转化作用引起[2，14]。同时，发酵后酸溶蛋白质的含量较发酵前显著提高，这与韩伟等[12]的研究结果一致。酸溶蛋白质含量的增加主要与微生物产生的蛋白酶分解大分子蛋白有关[9，19]。研究表明，在发酵过程中，微生物优先利用糖类等能量物质，间接导致发酵后物料中粗灰分含量提高[5，20]。Sun等[6]研究发现，固态发酵棉籽粕后，粗脂肪含量显著下降，与本试验结果不同，主要原因可能是前述研究中所用的微生物能够利用脂肪作为能量物质来支持自身的生长[5]，因而抵消了因能量损耗间接提高的粗脂肪含量。

韩伟等[12]在微生物固态发酵和酶解工艺处理棉籽粕的研究中发现，发酵和酶解棉籽粕相比原棉籽粕，氨基酸总量没有显著改变，但精氨酸含量降低1.4%～14.3%。何涛[21]研究报道，棉籽粕经过混菌发酵条件优化后，精氨酸含量有所下降。上述结果均与本研究一致。但另一方面，王婷[22]研究表明，棉籽粕经过混菌发酵后，各种氨基酸含量均有所增加，精氨酸提高了14.25%，与本研究的结果不同，这可能和2项研究所用的发酵微生物不同有关。发酵微生物的氨基酸利用偏好会直接影响发酵后的氨基酸含量变化[5]。

羟自由基是最具反应活性的氧自由基之一，能够造成动物机体内生物大分子的损伤，导致多种疾病的发生[23]。本试验结果表明，经过微生物固态发酵处理后，棉籽仁中提取的棉籽肽具有羟自由基清除能力，同时其对羟自由基的清除能力会随着发酵时间延长及其浓度增加而上升。此外，棉籽肽的DPPH清除能力、金属离子螯合能力和总还原能力同样与其发酵时间和使用浓度呈正相关。孙宏[16]、周向军等[24]的研究结果表明，棉籽肽的体外抗氧化活性与其使用量和发酵时间均有关。高丹丹等[25]研究发现，从棉籽中提取出来的棉籽肽具有较高的抗氧化活性。

目前，棉籽肽的抗氧化活性主要通过体外化学手段进行评价，动物性评价研究相对较少。孙宏[16]研究表明，棉籽肽及其组分A-8可增强胞内抗氧化酶的活性，抑制细胞氧化代谢物的产生，提高RAW264.7氧化损伤细胞的活性，减少细胞凋亡；同时，灌喂2%棉籽肽有助于缓解SD大鼠因饲喂高脂日粮产生的氧化应激，降低血清丙二醛(MDA)含量，提高其肝脏和血清中部分抗氧化酶的活力。Young等[26]研究报道，抗氧化肽对不同类别的抗氧化酶有不同的作用效果。张晓羊等[27]研究表明，饲喂6%的嗜酸乳杆菌发酵棉籽粕可显著提高黄羽肉鸡的平均日均增重，降低料肉比，同时能够增强黄羽肉鸡对蛋白质、脂肪和Ca等营养物质的消化吸收。以上试验结果提示，棉籽肽作为抗氧化肽具有一定的应用价值。发酵棉籽仁饲料应用前景广阔，但是还需要进一步开展动物养殖试验，以评价其应用效果。