利用外源γ-氨基丁酸调控海洋绿藻亚心形四爿藻淀粉积累

冉雯仪，项 琦，潘云云，姚长洪，张永奎

四川大学化学工程学院，四川成都 610065

微藻是一类广泛存在于海洋和陆地上的、低等的、可利用光合作用的藻类微生物总称[1]。微藻通过光合作用固定CO2生产各种细胞内代谢物如淀粉(碳水化合物)，脂质和蛋白，并且由于光合效率高，固定CO2能力强，生长速度快，培养模式灵活可控和不占用耕地等特点被认为是生物炼制的可持续原料来源[2]。

微藻可以在光合自养条件下通过营养限制、高光强等方式积累大量淀粉，在制取生物乙醇、生物丁醇等生物质能源方面有潜在的应用前景[3]。但目前制约其产业化的主要因素在于生物质和淀粉产率过低，使微藻培养、采收和后续加工的成本过高。提高生物质产量(培养液中微藻浓度，g·L-1)和产率(单位时间生产的生物质量，g·L-1·d-1)有利于降低微藻培养和采收成本，而目标产物产量和含量(占干重的百分比)的提高则有利于微藻的后续加工和炼制[4]。因此，微藻淀粉积累的调控需要同时考虑淀粉含量、生物质和淀粉的产量和产率。

应用各种化学物质调控细胞代谢已被证明是一种提高微藻储能物质(主要是脂质)积累的有效方法[5]。近年来，植物激素、抗氧化剂和相关通路的激活剂/抑制剂对微藻脂质积累的促进作用得到了广泛的研究[3]。然而，关于改进微藻淀粉生产的化学调节剂的研究进展很少。γ-氨基丁酸(GABA)是一种存在于植物、动物、细菌和微藻中的四碳非蛋白氨基酸[6]。GABA被认为是一种信号分子，以调节植物应对生物和非生物胁迫的生长代谢，比如盐度异常、干旱、内涝、冷热和缺氧[7-10]。最近有文献报道，在镉胁迫下，外源添加2.5 mmol/L的GABA可以增加产油微藻Monoraphidiumsp. QLY-1的生物质和脂质生产，进一步证明了GABA对微藻代谢调节的有效性[11]。然而，利用GABA调控微藻淀粉积累并未见报道。

亚心形四爿藻是一种海洋绿藻，在缺氮条件下该藻具有潜在的淀粉生产能力[12]。为了在提高淀粉产量的同时进一步提高淀粉含量，本研究分析了缺氮培养条件下，GABA对亚心形四爿藻细胞生长、生物质积累、淀粉生产和光合作用的调节作用，以证明利用外源添加GABA调控微藻淀粉生产的可行性。

1 材料和方法

1.1 藻株和实验条件

海洋绿藻亚心形四爿藻(Tetraselmissubcordiformis), 分离于大连附近海域, 经过本实验室纯化, 并保存在中国科学院淡水藻种库(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology, FACHB-collection), 编号为FACHB-1751。

微藻藻种在人工海水(ASW)中培养[13]，添加0.81 g·L-1的Tris和0.33 mL·L-1冰乙酸。在生长指数后期收集藻细胞，用缺N的人工海水(ASW-N)洗涤两次后重悬于ASW-N中，调整细胞初始接种密度(ICD)OD750为3.5。在缺N培养模式下添加GABA最终浓度为10 mmol/L，并以未添加GABA(0 mmol/L)的藻在相同条件下培养做对照。

藻细胞在YAO等人[14]描述的工作体积为500 mL (直径为50 mm, 高度为400 mm) 的600 mL的玻璃泡柱光生物反应器中进行自养培养。通入空气流量0.4 vvm, CO2含量2%, 培养温度(25±2) ℃。连续单排照光, 光照强度150 μmol·m-2·s-1。所有实验设3个生物学重复。

1.2 细胞生长的测定

在分光光度计(AOE, UV/Vis A-360, 上海, 中国) 750 nm 处测定细胞生长的光密度[12]。细胞干重(DW, g·L-1)根据YAO[14]的方法测定。

1.3 光合活性分析

应用快速荧光诱导动力学(OJIP-test)对微藻的光合性能进行评价。光合系统Ⅱ(PhotosystemⅡ, PSⅡ)最大光化学量子产量Fv/Fm, 在J-step(Vj)和I step(Vi)的相对可变荧光和单位 PSⅡ 捕光截面的能量耗散DIo/CS0用叶绿素荧光仪Os30p+(Opti-sciences, USA)测定叶绿素a荧光进行评估。各项参数Fv/Fm, DIo/CS0,Vj和Vi根据STRASSERF和SRIVASTAVA[15]进行如下计算:

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

DIo/CS0=F0(1-Fv/Fm)

Vj=(Fj-F0)/(Fm-F0)

Vi=(Fi-F0)/(Fm-F0)

Fv表示饱和脉冲诱导的最大荧光Fm与初始荧光F0之间的叶绿素荧光变化，Fj和Fi分别为J和I时期的荧光。

1.4 生化成分分析

Ps=(DWtCst-DW0Cs0)/t

式中:DWt和DW0分别是t时刻和初始时刻的干重，Cst和Cs0分别是t时刻和初始时刻的淀粉含量。蛋白质的提取参照YAO[13]的方法，用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白含量(碧云天，中国)。

1.5 镜检观察细胞淀粉积累

以1/1 (v/v)的海藻悬浮液/碘溶液 (0.2% I2, 2% KI) 比例染色，并在光学显微镜(BMC303-IPL, 上海, 中国)下观察藻细胞中的淀粉积累。

1.6 统计学分析

结果以三个独立实验的平均值±SD表示。采用SPSS 16.0 软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)进行统计分析。两组比较采用双尾分布student配对t检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 GABA对细胞生长的影响

为了评价添加GABA是否能提高胁迫条件下微藻淀粉的积累，研究在N缺乏的条件下添加10 mmol/L GABA于亚心形四爿藻，并与未添加GABA(0 mmol/L)的藻作对比。虽然藻细胞在缺氮下受到胁迫，但细胞可以利用内源性氮增殖，细胞密度在4 d内达到最大，之后停止生长。从培养的第0 d到第4 d，无添加(0 mmol/L) GABA的细胞密度增长了66%，而添加10 mmol/L GABA的藻细胞密度增长了54%(图1a)，表明GABA添加对细胞分裂有一定的抑制作用。在培养5 d时，添加10 mmol/L GABA的细胞密度为未添加GABA(0 mmol/L)的89.7%。然而，添加GABA对细胞生物质积累没有显著影响，缺氮培养4 d，与未添加组同样细胞干重大约增加了40.6%，均达到4.5 g·L-1(图1b)。这些结果与高等植物的情况不一致，比如添加外源GABA于玉米可以在幼苗长度和生物质积累方面改善幼苗生长[17]，说明GABA可能在亚心形四爿藻中发挥不同的作用。

星号(*)代表与0 mmol/L GABA对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)
图1 缺N条件下GABA对亚心形四爿藻

2.2 GABA对淀粉积累的影响

与细胞生长和生物质积累的情况不同，GABA可以促进亚心形四爿藻淀粉的积累。在培养的第1 d，未添加GABA的藻细胞淀粉呈现下降趋势(图2a)，这是由于细胞利用内源性N进行细胞分裂，藻细胞降解淀粉为细胞分裂和细胞骨架(比如蛋白质和膜脂质)的生物合成提供能量和碳骨架[18]；而添加10 mmol/L GABA的藻在培养的第1 d淀粉含量几乎保持不变，且细胞分裂也受到抑制(图1a)。藻细胞从第2 d起开始积累淀粉，且添加10 mmol/L GABA的藻细胞淀粉含量比未添加GABA的对照组的淀粉含量高。在培养的第4 d，添加10 mmol/L GABA的藻细胞淀粉含量达到39%DW，而未添加GABA的藻细胞淀粉含量仅为28%DW，表明添加GABA后淀粉含量显著性提高了39%(P<0.05)(图2a)。

通过碘染色的藻细胞也反映出添加GABA后淀粉含量的增加。如图3所示，在缺氮培养的第4 d，添加GABA的藻液与碘染色后在显微镜下观察颜色呈现褐色且比未添加GABA的藻细胞颜色更深，表明GABA促进了微藻细胞的淀粉积累，结论与图2中的淀粉生产情况相一致。

此外，从图4可以看出，在培养的第2 d，添加10 mmol/L GABA的微藻中蛋白含量为20% DW，比未添加GABA的对照组蛋白含量降低了13%。这些结果表明，GABA可能通过抑制细胞分裂降低淀粉的降解，且改变了光合碳流的分配，即从蛋白质合成更多地转换到淀粉的合成，促使藻细胞的淀粉含量提高。

淀粉合成的提高可以减小蛋白和油脂合成过程的CO2释放[19,20]，提高光合碳固定效率。因此，尽管GABA的添加抑制细胞生长(图1a)，但淀粉合成提高所带来的碳储存效率的增加导致生物质积累并不受影响(图1b)。由于GABA有利于淀粉含量的升高，因此GABA的添加也有利于淀粉产率的提高。如图2b所示，在培养第4 d，添加10 mmol/L GABA的微藻淀粉产量达到最大值1.72 g·L-1，比未添加GABA的对照组显著提高了39%(P<0.05)。同样地，添加10 mmol/L GABA的微藻淀粉产率在第4 d达到最大值0.36 g·L-1·d-1，而0 mmol/L GABA的对照组淀粉产率为0.24 g·L-1·d-1，提高了50%(P<0.05)(图2c)。

2.3 GABA对光合活性的影响

星号(*)代表与0 mmol/L GABA对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)图2 缺N条件GABA对亚心形四爿藻

0 mmol·L-1

10 mmol·L-1

图4 缺氮条件下GABA对亚心形四爿藻蛋白含量的影响

3 结论

GABA在缺氮培养模式下可以促进亚心形四爿藻淀粉积累。GABA可以调控亚心形四爿藻细胞分裂和代谢，产生适度的额外胁迫，抑制细胞生长，阻碍淀粉降解，促使细胞将碳流更多地分配到淀粉积累，从而导致藻细胞的淀粉含量、淀粉产量和淀粉产率提高。在N缺乏条件下添加10 mmol/L GABA，可以使亚心形四爿藻淀粉含量、淀粉产量和淀粉产率分别提高39%、39%和50%。添加GABA是提高微藻淀粉生产的有效途径，可能为淀粉基生物燃料和生物基化学品的生产提供可持续的绿色原料。