刘丽娇 杨秀丽 徐祥辉 秦 毅
1)新乡市第一人民医院神经内科,河南 新乡 453000 2)新乡医学院第三附属医院,河南 新乡 453000
急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)发病率约占脑卒中总人数的70.0%[1-2],并随我国人口老龄化趋势加剧呈增长态势,若未予以及时诊治,可触发炎症反应、氧化应激等一系列缺血级联病理事件,诱导脑血管内皮细胞、神经细胞凋亡及坏死[3-4]。目前诊断AIS多依赖于卒中量表评分、头颅CT或磁共振成像(MRI)影像学手段,但其诊断准确性均有待提高。近年来随着基因芯片技术快速发展,RNA作为疾病诊断的检测生物标志物已成现实。microRNA(miRNA)具有高组织特异性、相对稳定性及体液丰度等特点[5-6],能通过抑制转录或降解mRNA,达到调节靶基因转录后水平、介导血管生成、凋亡及氧化应激的目的,可作为潜在性组织损伤生物标志物[7-8]。miR-124是脑组织损伤诊断敏感性的循环生物标志物,在脑部神经发育、调控中枢神经功能中起重要作用[9]。miR-145是影响颈动脉粥样硬化(CAS)稳定性的重要基因,与颈动脉狭窄程度具有一定关联性[10]。但临床关于miR-124、miR-145在AIS诊断中的价值尚未完全阐明。本研究以血清miR-124、miR-145为观察指标,探讨其对AIS的诊断价值及与CAS斑块性质关联性。
1.1一般资料选取2017-07-2019-10新乡市第一人民医院收治的AIS患者82例为AIS组,男49例,女33例;年龄47~76(62.34±5.15)岁;体重指数18.4~26.4(21.96±1.53)kg/m2;根据美国国立卫生院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)轻度(NIHSS评分≤6分)18例,中度(NIHSS评分7~14分)40例,重度(NIHSS评分≥15分)24例;根据CAS斑块性质分为易损斑块45例,稳定斑块37例;并发症:高血脂12例,高血压25例,糖尿病8例,冠心病15例;有吸烟史15例。另选同期健康体检者82例为对照组,男52例,女30例;年龄48~78(61.86±4.93)岁;体重指数18.1~26.8(22.04±1.62)kg/m2;10例有吸烟史。2组基本资料(年龄、性别、体重指数、吸烟史)均衡可比(P>0.05)。本研究经新乡市第一人民医院医学伦理委员会批准。
1.2选取标准
1.2.1 纳入标准:①均符合《急性缺血性卒中静脉溶栓中国卒中学会科学声明》[11]中的AIS相关标准;②均经头颅CT或MRI等影像学检查确诊为AIS;③首次发病;④均于发病后≤72 h内入院;⑤临床资料完整;⑥患者或家属知情并签署承诺书。
1.2.2 排除标准:①合并急性冠状动脉综合征、瓣膜病、心房颤动、动脉炎及周围血管疾病者;②肝、肾等重要脏器器质性病变者;③合并短暂性脑缺血或脑出血疾病者;④全身感染性疾病者;⑤心源性栓塞型、小动脉闭塞型、其他病因型及不明原因型所致AIS者;⑥近期有免疫抑制剂治疗史者;⑦伴有恶性贫血、血液性疾病、甲状腺功能减退或亢进者;(8)精神行为异常者。
1.3方法采集肘静脉血10 mL,4 ℃条件下3 000 r/min,离心10 min,分离血清,置于-80 ℃冰箱保存待测。(1)RNA提取:按照mirVana PARIS试剂盒(购自美国ABI公司)说明书分离总RNA。通过RNase Free水洗涤,收集总RNA(100 μl),同时应用NanoDrop ND-1000核酸定量检测仪(购自美国NanoDrop公司)对RNA浓度、纯度进行检测。(2)实时逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR):引物购自美国MRC Gene公司,根据miScript SYBR Green Kit试剂盒说明书(美国Ambion公司)进行配制反应混合物,每个反应体系为20 μL,使用荧光定量PCR仪(型号LightCy-cler480:购自瑞士罗氏公司)检测。PCR反应条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,重复40个循环实施扩增反应,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s制备溶解曲线。将扩增产物进行电泳,在图像处理系统上分析、计算,得出miR-124、miR-145,GAPDH的光密度,以GAPDH的光密度为参照,求出miR-124、miR-145光密度的变化值(ΔCt),以2-Ct得到miR-124、miR-145相对表达量。每个反应重复3次。
1.4观察指标(1)对比2组血清miR-124、miR-145水平。(2)对比不同神经缺损程度患者血清miR-124、miR-145水平。(3)采用Logistic多因素回归分析AIS发病影响因素。(4)采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miR-124、miR-145诊断AIS的价值。(5)对比不同CAS斑块性质患者血清miR-124、miR-145水平。(6)采用Pearson线性相关性分析血清miR-124、miR-145水平与神经功能缺损程度、CAS斑块性质关联性。
2.1组血清miR-124、miR-145水平比较由表1可知,AIS组血清miR-124水平低于对照组,miR-145水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
组别nmiR124miR145AIS组822.68±0.898.04±2.62对照组823.89±0.735.28±1.59t值9.5198.155P值<0.001<0.001
2.2不同神经缺损程度患者血清miR-124、miR-145水平比较由表2可知,随神经功能缺损程度的加重,血清miR-124明显降低,血清miR-145水平明显增高(P<0.05)。
表2 不同神经缺损程度患者血清miR-124、miR-145 水平比较Table 2 Serum miR-124 and miR-145 levels in patients withdifferent degrees of neurological
2.3 AIS发病影响因素由表3可知,以是否发生AIS为因变量,将受试者年龄、性别、体质量与血清miR-124、miR-145为自变量实施Logistic回归分析,结果发现,血清miR-124、miR-145为AIS发病的重要影响因素(P<0.05)。
2.4诊断价值由表4、图1可知,经ROC曲线分析,血清miR-145诊断AIS的AUC(0.791)>miR-124(0.717),以7.25为截断值时,敏感度为64.63%、特异度为90.24%。
2.5不同CAS斑块性质患者血清指标水平比较易损斑块患者血清miR-124低于稳定斑块患者,血清miR-145水平高于稳定斑块患者(P<0.05)。见表5。
表3 AIS发病影响因素的Logistic回归分析结果Table 3 Logistic Regression Analysis Results of AISInfluencing Factors
表4 血清指标诊断AIS的ROC曲线Table 4 ROC curve of serum index for diagnosis of AIS
组别nmiR124miR145易损斑块患者452.36±0.788.72±2.79稳定斑块患者373.07±1.027.21±2.48t值3.5712.563P值0.0010.012
图1 ROC曲线Figure 1 ROC curve
2.6血清指标与神经功能缺损程度、CAS斑块性质关联性由表6、图2、图3可知,Pearson线性相关性分析可知,血清miR-124水平与神经功能缺损程度、CAS斑块性质呈显著负相关,血清miR-145水平与神经功能缺损程度、CAS斑块性质呈显著正相关(P<0.05)。
表6 血清指标与神经功能缺损程度、CAS斑块性质关联性 (n=82)Table 6 Correlation of serum indicators with neurologicaldeficits and CAS plaque properties (n=82)
数据显示,>70.0%AIS患者是由颈动脉血管粥样硬化所致[12-13]。同时相关研究指出,miRNA通过平滑肌细胞表型转化、增殖、迁移、炎性反应及泡沫细胞形成等多个过程调控CAS的发生发展[14-16]。因此动态监测相关miRNA水平变化,对评估AIS病情程度、识别颈动脉血管粥样硬化斑块性质具有重要作用。
miR-124作为中枢神经系统最丰富的miRNA,能够促进小胶质细胞、巨噬细胞转化为M2表型,从而避免神经元损伤[17-18]。LIU等[19]研究发现,血清miR-124水平在AIS患者中呈异常低表达状态,与本研究观点一致。研究[20]也证实,体外miR-124有助于促进抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达,显著增加M2表型的小胶质细胞/巨噬细胞,减轻神经炎症,且还能通过降解RE1沉默转录因子,抑制神经元凋亡,减少缺血性脑损伤、功能障碍,增强神经血管重塑[21],充分证实血清miR-124水平下调可能是导致AIS的风险因素之一。另外,JI等[22]认为,AIS患者血浆miR-124水平与梗死体积、NIHSS评分均具有正相关关系。同时通过大脑中动脉闭塞小鼠模型还发现[24],抑制miR-124表达够能显著增加模型小鼠的梗死体积,小鼠颅内注射miR-124拟似物脂质体后,脑梗死面积明显缩小,AIS患者神经功能缺损得到显著缓解。进一步经Logistic多因素回归分析、Pearson线性相关性分析发现,血清miR-124水平是AIS患者的保护因素,与神经功能缺损程度、CAS斑块性质存在明显负相关关系,与上述研究相符,充分证明miR-124低表达可能加重AIS患者神经功能缺损,增加CAS斑块破裂的风险性。
miR-145主要存在于血管平滑肌内,在血管平滑肌细胞表型转换过程中发挥重要作用,其水平上调,可引发血管平滑肌细胞增殖、凋亡紊乱,加重血管损伤。本研究对比2组血清miR-145水平可知,血清miR-145水平在AIS患者中出现异常高表达状态,并随神经缺损严重程度呈升高趋势,充分说明血清miR-145表达水平上调,可调控CD40L表达,释放大量血管内炎症因子,加重血管炎症反应,进而在AIS发生、发展中起促进作用,且miR-145水平高表达还能降低超氧化物歧化酶活性,参与脑缺血再灌注损伤的氧化应激过程,加重神经功能损伤程度。ROC曲线分析进一步证明,血清miR-145诊断AIS的AUC(0.791)>miR-124(0.717),且当截断值为7.25时,特异度高达90.24%,说明miR-145有望成为诊断AIS的特异性生物标志物,为临床早期AIS诊治提供新思路、新方向。另外,有学者指出,在缺氧条件下,miR-145表达下调是导致平滑肌细胞过度增殖、迁移,加重血管损伤后再狭窄程度,促进血管狭窄发生发展的重要因素之一。通过RT-PCR法检测不同CAS斑块性质患者可知,易损斑块患者血清miR-145水平明显高于稳定斑块患者,提示miR-145可能是识别CAS斑块性质的潜在标志物,故可通过调节血清miR-145水平,防止CAS斑块破裂,促进AIS病情转归。
血清miR-124、miR-145作为诊断AIS的潜在特异性生物标志物,与神经功能缺损程度、CAS斑块性质存在一定相关性,在AIS患者治疗过程中可通过调节血清miR-124、miR-145表达,发挥保护神经功能、抑制CAS斑块病变进展的作用。