电针对脓毒症心肌损伤病人microRNA-133a表达影响

孙芳园，张 纬，袁 林，汪 淼，许开亮，韩耀国，陈 刚，沈伟鸿

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，进一步可发展为脓毒性休克及多器官功能障碍，患病率和死亡率高[1]。脓毒症的高发病率及病死率使其成为严峻的世界性医学问题，心脏作为循环系统的中心，是脓毒症重要的受损靶器官[2]。研究[3]表明，有40%～50%的脓毒症病人具有心肌损伤，其病死率高达70%～90%，而不具有心肌损伤的病死率远远减低，为20%，临床表现为心脏心室扩张、射血分数下降和对容量负荷收缩反应差等。电针治疗脓毒症心肌损伤，有独特优势。本人就电针对脓毒症心肌损伤病人microRNA-133a表达及microRNA-133a在脓毒症心肌损伤病理过程的调控作用作一探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择上海市第七人民医院2015年10月至2017年10月收治住院的脓毒症心肌损伤病人60例，男31例，女29例，年龄47～85岁。按入住 ICU 先后随机分组,对照组30例，男16例，女14例，年龄(65.37±8.29)岁；电针组30例，男15例，女15例，年龄(66.42±9.15)岁。原发病分布：肺部感染(包括肺炎和慢性阻塞性肺疾病、哮喘)18例，腹腔感染(肝脏和胆道感染)15例，肾结石并泌尿系感染9例，手术后败血症13例，其他5例。2组一般资料具有可比性。病例排除标准：感染性心内膜炎，风湿性心脏病，瓣膜性心肌病，先天性心脏病，代谢性心肌病，原发性心肌病等严重心脏病病人；心肺复苏术后病人；合并肿瘤及自身免疫性疾病病人；针刺部位皮肤溃破、晕针病人；不同意参加临床试验。所有受试者均签署知情同意书，并经上海市第七人民医院伦理委员会批准。

1.2 治疗方法

1.2.1 对照组 西医常规治疗。按重症监护室治疗方案，按EGDT标准初始复苏；感染的诊断、感染源控制、早期抗菌药物治疗；液体治疗、缩血管药物(统一使用去甲肾上腺素)、正性肌力药物治疗；皮质醇激素治疗；血液制品应用；免疫球蛋白；镇静、镇痛和肌松剂；机械通气；连续性肾脏替代治疗；碳酸氢钠应用；血糖控制；深静脉血栓的预防；应激性溃病的预防；营养支持。

1.2.2 电针组 中西医结合治疗。在西医常规治疗的基础上，予以电针取穴，取双侧内关、足三里、神门、太冲、血海、膈腧、三阴交、合谷。每日2次，每次30 min。

1.3 观察指标 入院24 h内采集肘静脉血液2～3 mL，置于EDTA抗凝管。3 000 r/min离心血液，取上清于去RNAase的EP管内，储存于-80 ℃冰箱备用。治疗前和治疗7 d后酶联免疫吸附法检测肌钙蛋白(cTnT)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)含量。酶联免疫试剂盒购自深圳市科润达生物工程有限公司。qRT-PCR法测定microRNA-133a表达(Taq Man试剂盒，Applied Biosystems，美国)，内参选择U6。通过2-ΔΔCt法测定microRNA相对表达。床旁超声检测左心室射血分数(LVEF)，计算急性生理与慢性健康评分(APACHE Ⅱ)。

1.4 统计学方法 采用t检验和Pearson相关分析。

2 结果

2.1 治疗后受试者临床指标比较 电针组病人cTnT、LVEF、APACHE Ⅱ较对照组有明显改变(P<0.01)(见表1)。

表1 治疗后受试者临床指标比较

2.2 2组病人TNF-α、Bcl-2、IL-6含量比较 经过治疗后，电针组病人Bcl-2 表达水平明显高于对照组(P<0.01),TNF-α、IL-6均明显低于对照组(P<0.01)(见表2)。

表2 2组血清TNF-α、Bcl-2、IL-6含量比较

2.3 2组病人cTnT、microRNA-133a、caspase-3含量比较 电针组病人cTNT、microRNA-133a及caspase-3表达水平均明显低于对照组(P<0.01)(见表3)。

分组ncTnT/(ng/mL) microRNA-133acaspase-3电针组300.16±0.053.28±1.672.97±0.35对照组300.35±0.046.58±1.454.63±1.75t—15.648.185.12P—<0.01<0.01<0.01

2.4 各指标与miRNA-133a相关性分析 TNF-α、Bcl-2、IL-6、cTnT与miRNA-133a表达均呈明显正相关关系(r=0.91、0.92、0.94、0.89、0.93，P<0.01)(见图1～3)。

3 讨论

脓毒症心肌损伤死亡率高，容易加重病情，转化为严重脓毒症、多脏器功能损伤而使病情急转直下，早期识别并治疗脓毒症心肌损伤具有重大的意义[1]。心肌损伤的主要诊断指标为cTnT、超声心动图，但都存在着一定的局限性。明确心肌损伤的病理生理过程，分子机制将为脓毒症心肌损伤的诊断和治疗带来重要的启示。

细胞凋亡是受基因严格控制的，有研究[5]表明，在心肌缺血梗死的过程中有心肌细胞凋亡的发生，众多miRNA参与了凋亡过程。miRNA种类众多，不编码蛋白质，但能通过与mRNA特异结合，抑制转录后基因表达，从而调控细胞的生长、发育、分化和凋亡。

miRNA-133是肌肉组织表达特异性的miRNA，广泛参与了心脏发育、心肌肥厚、心肌损伤、凋亡和心律失常等心脏生理和病理过程[5]。miRNA-133家族中的miRNA-133a对于心肌细胞的抗凋亡作用极其强大，可通过间接抑制caspase-3活性，进而抑制心肌细胞凋亡[6]，但在人体中是如何变化的，尚无一定结论。本研究发现，脓毒症心肌损伤时，micorRNA-133a升高，随着治疗的进行，逐渐减低，在电针组治疗降得更低，提示与病情变化负相关，与动物实验的部分结论相悖，考虑可能的原因是人体和动物实验有别，且炎症反应是个双向化的过程，其中很多通路尚未阐明，有待进一步实验验证。

Caspase家族、Bcl-2家族在细胞凋亡过程中扮演着关键的调控作用[7]。Caspase-3是执行凋亡程序的关键分子，是细胞凋亡过程中的主要执行者和效应因子[8]。Bcl-2家族蛋白可在线粒体上与其他凋亡蛋白协作，共同调控线粒体的稳定性，发挥执行细胞凋亡的主要作用[7]。我们推测抗凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子caspase-3都接受miRNA-133a的调控，本研究发现miRNA-133a与Bcl-2、TNF-α、IL-6都存在着显著的线性关系，证实心肌凋亡通路是与这些因子相关的，但具体的变化时限和程度，则有待进一步的实验加以验证。本研究还证实，microRNA-133a与cTnT、APACHE Ⅱ存在相关性，可以作为临床诊断脓毒症心肌损伤的一个指标，在早期即实施基因检测，明确病人病情，及时对因对症治疗。

内关穴是手厥阴心包经之络穴，八脉交会穴之一，针刺内关穴是治疗心腹诸病的重要穴位，历来就有“心胸内关谋”的经典论述。近年来，对内关穴治疗心血管疾病的实验室研究较多，如林亚平等[9-10]通过对电针内关对心肌缺血再灌注损伤模型的研究，提示电针内关穴可减少心肌缺血再灌注损伤过程中肌钙蛋白T的释放。根据李忠仁《实验针灸学》进行定位，电针刺足三里可减轻脓毒症大鼠心肌受损程度，改善血流动力学指标，起到心脏保护作用，其机制可能与抑制炎性因子TNF-α和IL-6释放，减轻过氧化损伤有关[11-12]。组方配穴还选取了神门、三阴交、太冲、合谷、血海、膈腧，心主血脉，心病推动无力，则有血瘀，血海、膈腧活血化瘀；太冲、合谷为四关穴，针四关有行气血，通经络，清滞瘀之效果；神门为心经原穴，主心病，补益心气，安定心神，配三阴交安神定志。全方共奏补心气、通血脉、化瘀滞的效果。本研究研究发现，电针辅助治疗可以显著改善脓毒症心肌损伤病人的miRNA-133a、Bcl-2、caspase-3、TNF-α、IL-6等指标，为临床推广应用提供了良好的依据，对研究针灸防治脓毒症心肌损伤具有重要意义。本试验所有受试病人未见明显不良反应。