诃子鞣质与一线二线抗结核药物联合对耐药性结核分枝杆菌活性研究

宋青山 贾芳

[摘           要]  从临床分离得到439株MDR菌株，得到38株XDR菌株。诃子鞣质对敏感株的抑菌浓度为50μg/mL～100μg/mL， 诃子鞣质对MDR、XDR菌株的抑菌浓度为50μg/mL～200μg/mL。诃子鞣质与三种一线抗结核药物中任意一种联合作用于MDR的协同效果显著高于XDR。诃子鞣质与三种二线抗结核药物中任意一种联合作用于MDR的协同效果显著高于XDR。

[关    键   词]  诃子鞣质;结核分枝杆菌;抗结核药物

[中图分类号]  R52               [文献标志码]  A           [文章编号]  2096-0603（2020）44-0086-03

结核病仍然是一个世界公共卫生问题，全世界每年大约有900万新增病例[1]。

尤其是广泛耐药结核病（XDR-TB）的出现，给全球结核病控制带来了极大的挑战。

研究报道中药或中药提取物或中药制剂联合标准化抗结核化疗治疗耐多药结核分枝杆菌取得了一定进展，在茜草素联合标准抗结核化疗方案治疗耐多药肺结核协同作用的研究中发现，茜草素对人型结核分枝杆菌标准菌株（H37RV）最低抑菌浓度为80ug/mL，联合西药时显示出对耐药菌株抑杀作用，而又不表现出伤肝的缺点[2]。诃子（Terminalia chebula Retz）是君子科植物诃子成熟的果实，是蒙药、藏药中的最常用药[3]。本研究为进一步研究诃子鞣质抗结核分枝杆菌活性提供试验数据，在临床治疗耐药结核病中提供理论指导。

一、材料与方法

（一）药物

一线二线抗结核药物购于银科医学工程股份有限公司。诃子鞣质购于中国标准物质。

（二）菌株

菌株分离于2016年11月—2017年7月北京胸科医院国家结核病临床实验室确诊的住院结核分枝杆菌培阳的结核患者痰液。

（三）方法

1.单独药敏试验

药敏试验按照中国防痨协会《结核病检验细菌学检验规程》，采用WHO推荐的微孔板法，进行16种（包括抗结核一线和二线药物）抗结核菌药敏实验组套。接种菌悬液的制备：挑取一菌环菌体于Middlebrook 7H9液体培养基中并研磨，1：20稀释后使用。用MABA法（阿尔马兰法）与Middlebrook 7H9液体培养基二倍稀释法测定诃子鞣质或者抗生素类药物对人型结核分枝杆菌标准菌株（H37RV）、敏感株、MDR、XDR菌株的最低抑菌浓度[4]。判定方法为粉红色记录为阳性生长孔。最低抑菌浓度（MIC）定义为阻止颜色变为粉红色的最低药物浓度。

2.联合药敏试验

联合药用的方法采用棋盘法。利用部分抑菌浓度指数（fractional  inhibitory concentration index，FICI） 判定联合用药效果，FICI=（MICa联合/MICa单独）+（MICb联合/MICb单独），FICI≤0.5，两者协同;0.5﹤FIC≤1，两者不相关;FIC>1，两者拮抗。

（四）统计方法

针对XDR-TB患者一线二线抗结核药物耐药情况各组分间的差异用卡方检验或Fisher′确切值检验，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

（一）敏感株、MDR、XDR菌株的筛选

在此次药敏试验中一共收集到敏感株2494株，MDR菌株439株，XDR菌株38株。其中XDR菌株中耐藥卡那霉素有13例，卷曲霉素有10例，阿米卡星有16例，里面包括同时耐卡那霉素和卷曲霉素5例，同时耐卡那霉素、卷曲霉素和阿米卡星2例。

（二）诃子鞣质对敏感株、MDR、XDR菌株的敏感性

诃子鞣质对敏感株的抑菌浓度为50μg/mL～100μg/mL，诃子鞣质对MDR、XDR菌株的抑菌浓度为50μg/mL～200μg/mL。

（三）诃子鞣质联合一线抗结核药物药敏分析

诃子鞣质联合INH、RFP和SM作用于结核分枝杆菌标准株H37Rv（ATCC 27294）和8株MDR、XDR的体外协同抗菌活性作用效果（见表2）。诃子鞣质联合INH、RFP和SM作用于4株MDR均具有协同作用，且MIC值显著下降。与诃子鞣质联合后，INH的MIC值下降8～32倍（FICIs 0.250-0.375）、RFP的MIC值下降1～4倍（FICIs 0.240-0.375）、SM的MIC值下降1～4倍（FICIs 0.165-0.275）。诃子鞣质对结核分枝杆菌标准株H37Rv和XDR的联合药敏结果表明，它们之间不相关，FICIs为0.562～1.063。研究发现，当诃子鞣质与三种抗结核药物中任意一种联合作用于MDR的协同效果显著高于XDR。

（四）诃子鞣质联合二线抗结核药物药敏分析

诃子鞣质联合Km、Cm和Am作用于结核分枝杆菌标准株H37Rv（ATCC 27294）和8株MDR、XDR的体外协同抗菌活性作用效果（见表2）。诃子鞣质联合Km、Cm和Am作用于4株MDR均具有协同作用，且MIC值显著下降。与诃子鞣质联合后，INH的MIC值下降4～16倍（FICIs 0.250～0.375）、RFP的MIC值下降2～4倍（FICIs 0.281～0.375）、SM的MIC值下降1～2倍（FICIs 0.253～0.321）。诃子鞣质对结核分枝杆菌标准株H37Rv和XDR的联合药敏结果表明，它们之间不相关，FICIs为0.562～1.063。研究发现，当诃子鞣质与三种抗结核药物中任意一种联合作用于MDR的协同效果显著高于XDR。

三、讨论

結核病也是我国重点控制的慢性呼吸道传染病之一。经过短程督导治疗大多数肺结核患者是可以治愈，但是耐多药的结核菌出现给临床的治疗带来了极大的困难。耐多药结核病（MDR-TB）是至少同时耐利福平和异烟肼的结核病[5];对于MDR-TB患者还需要使用二线抗结核药物，但近年来，在MDR-TB的基础上，又出现了对氟喹诺酮类药物和至少对包括（卡那霉素、卷曲霉素、阿米卡星）三种二线抗结核注射类药物一种耐药的广泛耐药结核病（XDR-TB）[6]。然而XDR-TB的出现给全球结核病控制带来了极大的挑战。诃子在蒙药中的应用比例最大，功用最广泛，被称为“蒙药之王”。诃子对革兰阳性和革兰阴性细菌均有抑制作用。诃子的乙醇提取物对耐甲氧嘧啶（SXT）/磺胺甲唑（TMP）的大肠杆菌的抗菌活性效果很好[7];诃子的果实提取物没食子酸及其乙酯对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌具有很强的抑制作用，诃子的酸性乙醚提取物和乙醇提取物均具有一定的抗真菌活性[8]，对生物被膜的形成也有抑制作用[9];诃子在体内、外均能抑制阿昔洛韦耐药的单纯性疱疹病毒;同时，诃子具有一定的抗疟原虫和抗阿米巴原虫活性[10]。可见，诃子及其提取物对细菌、真菌、寄生虫及其病毒均有抵抗作用。中药诃子鞣质与INH、RFP和SM联合发现有较好抗结核分枝杆菌药理活性，且在MDR中能发挥出两者联用的协同作用。

参考文献：

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[2]丁汀，刘伟，徐金田，等.茜草素联合抗结核西药对耐多药结核分枝杆菌体外抗菌活性研究[J].中华医院感染学杂志，2016，26（18）：4107-4109.

[3]张海龙，裴月湖，华会明.诃子化学成分及药理活性的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2001，6（19）：452-455.

[4]邢立群，贾芳.甘草次酸联合抗结核药对结核杆菌活性研究[J].中国畜牧兽医2014，41（4）：160-164.

[5]李静，沈鑫，张阳奕，等.上海地区MDR-TB患者二线药物耐药危险因素分析[A].2011年中国防痨协会全国学术会议论文集[C]，2011.

[6]Abubakar I，Moore J，Drobniewski F，etal.Exten-sively drug resistant  tuberculosis in the UK：1995 to 2007[J].Thorax，2009，64（6）：512-515.

[7]Malekazadeh F，Ehsasnifar H，Shahamat M.Anti-

bacterial activity of black myrobalan（Terminalia chebula Retz）against Helicobacter pylori[J].Internation journal of antimicrobial Agents，2001（18）：85-88.

[8]Sato Y，Oketani H，Singyouchi K.Extraction and purification of effective antimicrobial constiuents of Term-

inalia chebula REtS against methicillinresistant Staphy-lococcus aureus[J].BiolPharm Bull，1997，20（4）：401.

[9]向丽，周铁军，叶迎春，等.诃子鞣质对白色念珠菌及其生物被膜的影响[J].重庆医学，2013，42（2）：134-137.

[10]Pinmai K，Hiriote W，Soonthornchareonnon N，etal.Invitro and in vivo anti Plasmodial activity and cytotoxicityof water extracts of Phyllanthus emblica，Terminalia chebula，and Terminalia bellerica[J].J Med Assoc Thai，2010，93（Suppl7）：S120.

◎编辑 曾彦慧