复合酶法提取小米多酚及其抗油脂氧化作用的研究

闫巧珍，李玮钰，李玥霞，王晓闻，朱俊玲

(山西农业大学 食品科学与工程学院，山西功能食品研究院，山西 太谷 030801)

小米又名粟，属禾本科，是五谷之首。小米中含有丰富的营养物质如蛋白质、氨基酸、多酚活性物质及优质不饱和脂肪酸等，易被人体吸收利用[1]。小米中的多酚类物质含量较高，种类较多，包含黄酮类、单宁类、酚酸类、花色苷类等，尤其是黄酮类物质含量极为丰富，这些生理活性物质表现出抗氧化、抑菌、清除自由基、抗衰老等独特的生理功能[2]。

目前常用的小米多酚提取方法有溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等。这些方法存在着得率较低、溶剂浪费的缺点。酶法提取技术已经被广泛应用，生物酶可通过水解植物细胞壁使细胞膜内物质溶出，在提取过程中适当地加入酶有利于多酚的浸出，且反应温度较低，可有效提高小米多酚的得率[3]。

目前，在调味品等食品行业中，食品添加剂的应用十分广泛，但是市售调味品中所使用的添加剂大多数为人工合成，存在着一定的危险性，如：抗氧化剂BHA、BHT、TBHQ等。所以，天然提取物作为添加剂应用在调味品等食品行业成为近些年来研究的热点。丁培峰等[4]将纳他霉素和茶多酚添加到酱油中，其防腐、抗氧化效果十分明显且安全性大大提高。刁文睿等[5]研究了山西老陈醋在浸渍花生的过程中，花生多酚提取物对DPPH、ABTS自由基的清除能力都有显著增加，说明多酚能很好地应用到调味品行业，从而提高调味品的营养价值。杨瑞丽等[6]添加茶多酚量达到0.5%时，对花椒油有很好的抗氧化效果。小米多酚中黄酮类化合物极为丰富，研究表明黄酮类作为一种天然色素对油脂有一定抗氧化作用，因此进一步增强其抗氧化性，发挥小米多酚的抗氧化能力，将这一优势运用到调味品等食品行业中，对提高其营养价值和保健功能具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米(东方亮1号)、大豆油。

纤维素酶(10万U/g)、果胶酶(5万U/g)：南宁庞博生物工程有限公司；没食子酸：天津市致远化学试剂有限公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司；聚甘油酯：郑州市鸿科化工产品有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)：英博生物科技有限公司；叔丁基对苯二酚(TBHQ)：山东优索化工科技有限公司；AB-8大孔树脂：东鸿化工有限公司；所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1100 可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；SC-3610 低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；YHG-400-BS-Ⅱ远红外快速恒温干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司；ST3100 实验室pH计 奥豪斯仪器(常州)有限公司；RE-52AA 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FA25 高速组织分散均质机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；BT-100B数显恒流泵、DBS-100电脑全自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

将小米粉碎，过80目筛，脱脂、干燥处理后的小米粉密封避光保存。

1.3.2 小米多酚物质的提取

精确称取5 g小米粉，加酶，摇匀。按试验设计的方案，调节溶液pH，在设定的温度下水浴一定时间后，冷却离心，取上清液，得到待测液Ⅰ。取滤渣，加入70%乙醇，40 ℃下水浴1 h，离心，取上清液，得到待测液Ⅱ，合并提取液Ⅰ和Ⅱ， 并通过旋转蒸发浓缩至一定体积，测定小米多酚得率。

1.3.3 小米多酚物质的测定

1.3.3.1 没食子酸标准曲线的绘制

配制浓度为 0.01 mg/mL 的标准溶液，分别取1，2，3，4，5 mL 配制成的没食子酸溶液，通过福林酚比色法测定吸光度。参照王若兰等[7]采用微波辅助乙醇提取小米多酚的研究，稍加修改。绘制没食子酸标准曲线。

1.3.3.2 小米多酚含量的测定

取小米多酚提取液 1 mL，通过福林酚比色法测定并记录吸光值，计算出小米多酚得率，计算公式如下：

式中：K为提取液的多酚得率(%)；C为与提取液吸光度对应的多酚质量浓度(mg/mL)；N为稀释倍数；V为小米多酚提取液的体积(mL)；W为小米粉末质量(g)。

1.3.4 酶法提取小米多酚的单因素试验

精确称取5 g小米粉，分别加入纤维素酶、果胶酶以及一定比例的混合酶(纤维素酶∶果胶酶为1∶1；纤维素酶∶果胶酶为7∶3；纤维素酶∶果胶酶为3∶7)，其酶浓度分别设置为0、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，其中0为空白对照；酶解时间设置为30，60，90，120，150 min；酶解温度设置为30，40，50，60，70 ℃；pH值设置为2.5，3，3.5，4，4.5，5。根据预试验结果，采用控制单一变量的方法，探究酶种类和各单因素对得率的影响，确定各单因素最佳水平[8]。

1.3.5 响应面法优化试验

以小米多酚得率为响应值，探究4个单因素之间的交互作用与响应值的关系，优化酶法提取小米多酚的工艺参数，从而得出最优工艺条件，并且在此条件下进行验证试验。

1.3.6 小米多酚提取物抗油脂氧化作用试验

按上述方法提取小米多酚冻干成粉，参考王若兰等[9]采用大孔树脂分离纯化小米多酚的方法和条件，将小米多酚进行分离纯化，其纯度由16.7%提高到了49.2%，提高了2.9倍。

参考国家标准GB/T 5009.37-2003[10]，采用Schaal烘箱法，将不同浓度梯度纯化后的小米多酚提取物0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%与乳化剂(4%聚甘油酯)漩涡混合后，加入20 g大豆油进行均质化处理。混合均匀后置于250 mL广口瓶中，密封放置于60 ℃电热烘箱中氧化，放置8 d，每隔2 d(第0，2，4，6，8天)定时取样测定其酸价(AV)和过氧化值(POV)。

通过POV和AV探究不同比例对小米多酚抗油脂氧化的影响，确定其最佳比例浓度。同时，在最佳比例浓度下分别与等浓度(不超过国家标准添加量0.02%)TBHQ、BHT、BHA的抗氧化性进行比较，探究小米多酚抗氧化性的强弱。

1.3.6.1 POV的测定

根据国家标准规定的滴定法测定[11]。

1.3.6.2 AV的测定

根据国家标准规定的滴定法测定[12]。

1.3.7 数据分析与处理

试验数据采用Excel数据统计软件录入，作图均采用Origin 9.1进行绘制，运用 Design-Expert 10.0.8 软件进行响应面分析，所有试验独立重复3次。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 The standard curve of gallic acid

由图1可知，回归方程为 y=14.65x+0.0559，R2=0.9992。没食子酸浓度与吸光值呈现出良好的线性关系。

2.2 复合酶提取小米多酚的单因素试验

2.2.1 酶种类及浓度的选择

按照试验设计方案，不同酶比例及酶浓度对小米多酚得率影响结果见表1。

表1 不同酶在不同浓度下的多酚得率Table 1 Polyphenols yield of different enzymes at different concentration

由表1可知，当纤维素酶∶果胶酶的比例为7∶3时，多酚得率最大，说明复合酶较单一酶作用效果好，故选取复合酶(纤维素酶∶果胶酶为7∶3)用作后续试验研究。其他条件不变时，通过无酶溶剂萃取得到的多酚得率仅为0.66%。随着酶浓度的增加，多酚得率增加，酶浓度大于1.0%时，多酚得率没有显著增大，这可能是因为酶和底物接触受到限制。随着酶浓度的升高，反应过程中逐渐消耗底物，使过量的酶不能充分发挥作用。考虑到成本，确定最佳酶浓度为1.0%，此时小米多酚得率为1.35%。

2.2.2 酶解时间对小米多酚得率的影响

设定单一变量为酶解时间，按照试验设计提取小米多酚，结果见图2。

图2 酶解时间对小米多酚得率的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of millet polyphenols

多酚得率随着酶解时间的延长先升高后降低，当时间达到90 min时多酚得率最高。当酶解时间小于90 min 时，由于时间过短，使多酚无法充分溶出，导致得率偏低；当酶解时间大于90 min时，由于时间过长，酚酸类物质发生氧化分解，导致多酚得率偏低。因此，酶解时间选为90 min，此时小米得率为1.41%[13]。

2.2.3 酶解温度对小米多酚得率的影响

设定单一变量为酶解温度，按照试验设计提取小米多酚，结果见图3。

图3 酶解温度对小米多酚得率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of millet polyphenols

由图3可知，多酚得率随着温度的升高先升高后降低，当温度为60 ℃时得率最高。当温度高于60 ℃时，酶容易受热变性使活性降低。此外，小米多酚得率明显下降可能是提取温度过高，多酚物质对热极不稳定，使得多酚物质的结构受到破坏，直接影响了多酚的得率。因此，酶解温度选为 60 ℃，此时小米多酚得率为1.15%。

2.2.4 pH对小米多酚得率的影响

设定 pH值为单一变量，按照试验设计提取小米多酚，结果见图 4。

图4 pH值对小米多酚得率的影响Fig.4 Effect of pH values on the yield of millet polyphenols

由图4可知，当 pH 值低于3时，随着pH值增加，多酚得率显著增加；当pH值为3时，得率达到最大；当pH值大于3时，多酚得率逐渐降低，表明酶活性受到pH影响，酶的构象和底物的解离状态发生变化[14]。因此，确定最佳pH值为3，小米得率为1.11%。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计与试验结果

试验设计因素水平见表2，试验设计与结果见表3。

表2 试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 响应面设计试验结果Table 3 Response surface design test results

运用 Design-Expert 10.0.8软件对 29个试验点响应值进行回归分析，拟合后各个单因素的回归模型为：Y=+1.514+0.047A-0.022B-0.050C+2.500E-003D+0.015AB-5.000E-003AC+5.000E-003AD-0.035BC+0.040BD+0.053CD-0.065A2-0.0874B2-0.114C2-0.081D2,调整后得：Y=+1.514+0.047A-0.022B-0.050C-0.035BC+0.040BD+0.053CD-0.065A2-0.0874B2-0.114C2-0.081D2。

方差分析见表4，回归模型极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P=0.3678)，证明可用本模型进行试验分析和预测， R2=95.18%，RAdj2=90.36%，说明回归拟合度较好。各考察因素对小米多酚得率影响顺序依次为：A>C>B>D，即：酶浓度>酶解温度>酶解时间>pH值。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

注：“*”表示显著(0.01

2.3.2 各因素相互作用对小米多酚得率的影响

该试验建立的模型中C，D的交互项在0.01水平极显著，B，C和B，D的交互项在0.05水平显著。因此，各测试因子对响应值的影响不是简单的线性关系，仅靠简单的单因素试验不足以确定最佳工艺参数。C与D、B与C、B与D的交互作用对响应值的影响见图5～图7。

图5 酶解温度和pH值对小米多酚得率的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and pH value on the yield of millet polyphenols

图6 酶解时间和酶解温度对小米多酚得率的影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis temperature on the yield of millet polyphenols

图7 酶解时间和pH值对小米多酚得率的影响Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis time and pH value on the yield of millet polyphenols

由图5～图7可知，C与D、B与C、B与D两两之间存在着相互作用，尤其是C与D之间更为显著。由响应面图可知，C与D之间曲面陡峭，等高线图呈现椭圆形，B与C、B与D之间曲面较为陡峭，等高线图较为椭圆，这与方差分析的结果相符合[15]。

2.3.3 响应面试验的验证试验

在-1～1水平内，各因素对响应值都有一个最优条件。根据分析得出最优值，即纤维素酶浓度为 1.072%，酶解时间为88.157 min，酶解温度为57.704 ℃，pH值为2.969。此时，模型预测值为1.529%。考虑试验的实际性和合理性，选择酶浓度为1.1%，酶解时间为88 min，酶解温度为58 ℃，pH值为3.0，进行3次重复试验，测得小米多酚的得率为1.521%±0.004%，与预测值十分接近，表明通过响应面法试验得到的结论是可靠的。

2.4 小米多酚抗油脂氧化试验

2.4.1 小米多酚最佳混合比例的确定

通过对大豆油的AV和POV进行定时测定，分别得出0，2，4，6，8 d后各小米多酚浓度对大豆油酸败抑制效果的影响，见图8和图9。

图8 不同浓度小米多酚添加量对大豆油酸价的影响Fig.8 Effect of different concentration of millet polyphenols on the acid value of soybean oil

图9 不同浓度小米多酚添加量对大豆油过氧化值的影响Fig.9 Effect of different concentration of millet polyphenols on the peroxide value of soybean oil

由图8和图9可知，大豆油的AV和POV随加速氧化时间的延长均呈上升趋势，对照组和各个试验组均表现出一定的酸败，高温加快油脂的酸败速度。各试验组所测定的AV和POV均高于空白对照组，说明小米多酚对大豆油的氧化能够起到一定的抑制作用。加速氧化到第8天时，对照组与各试验组的AV和POV均出现较大的差距，酸败程度不一。当小米多酚的浓度小于0.02%时，大豆油的AV与POV和小米多酚的添加浓度呈现出负相关，当小米多酚的添加量为0.02%时，AV和POV最低，分别为3.0 mg/g和0.54 g/100 g，仅为空白对照组的65.2%、64.96%。当多酚浓度大于0.02%时，AV和POV继续升高，不再呈现负相关，抗氧化效果减弱。这可能是因为多酚被氧化后出现副反应产生自由基后引发了连锁反应，故浓度较高的多酚对油脂抗氧化表现出较差的效果。

2.4.2 小米多酚与抗氧化剂抗氧化效果的比较

0.02%小米多酚浓度为抑制大豆油酸败的最佳浓度，将此浓度下的小米多酚与人工合成的抗氧化剂(BHA、BHT、TBHQ)进行抗氧化效果的比较。根据国家标准规定BHA、BHT、TBHQ在基本不含水的脂肪和油中最大添加量为0.2 g/kg[16]，故可采用等浓度的抗氧化剂进行试验。通过POV和AV的测定，得出小米多酚与其他抗氧化剂抗油脂氧化效果，见图10和图11。

图10 小米多酚与BHA、BHT、TBHQ作用下大豆油AV的比较Fig.10 Comparison of soybean oil acid value under the action of millet polyphenols, BHA, BHT and TBHQ

图11 小米多酚与BHA、BHT、TBHQ作用下大豆油POV的比较Fig.11 Comparison of peroxide value of soybean oil under the action of millet polyphenols, BHA, BHT and TBHQ

对照组和各试验组的AV和POV均呈上升趋势，且高温加快了氧化速度，空白对照(CK)的POV与AV都明显高于各试验组，各种抗氧化剂都体现出了较强的抗氧化性能。第8天测定时，各试验组的POV与AV分别为小米多酚：0.56 g/100 g，3.0 mg/g；BHA：0.6 g/100 g，3.4 mg/g；BHT：0.68 g/100 g，3.6 mg/g；TBHQ：0.48 g/100 g，2.6 mg/g，得出抗氧化效果由高到低依次为：TBHQ>小米多酚>BHA>BHT。

3 结论

本试验采用酶法提取小米多酚，得出最佳工艺条件为：在纤维素酶和果胶酶的最佳比例为7∶3的条件下，选择酶浓度为1.1%，酶解时间为88 min，酶解温度为58 ℃，pH值为3，得出小米多酚得率为1.521%±0.004%。在小米多酚的抗油脂氧化试验中，当小米多酚的添加量为0.02%时，抗氧化效果最佳，与同等浓度的人工合成抗氧化剂相比，其抗氧化性强于BHA和BHT，逊色于TBHQ，体现出良好的抗氧化性能。故将小米多酚提取物作为添加剂运用到芝麻油、蚝油、虾油、橄榄油等调味中具有重大的现实意义，能够在改善食品味道的同时提高其安全性和营养价值。