糖基化酪蛋白消化物对正常小鼠免疫调节作用的影响

时 佳，赵新淮*

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

蛋白质糖基化是将亲水的碳水化合物（单糖、寡糖）共价连接到蛋白质分子上，从而改变蛋白质的结构、构象、净电荷、疏水性等性质，最终实现蛋白质功能性质的改变，如溶解性、表面性质、吸水性、胶凝性以及热稳定性等。美拉德反应是实现蛋白质糖基化的最常用途径之一[1-2]。例如，燕麦分离蛋白和蘑菇β-葡聚糖发生美拉德糖基化反应，修饰后的燕麦分离蛋白的溶解性、乳化活性和热稳定性都得到改善[3]。大米蛋白和葡聚糖发生美拉德糖基化反应后，其溶解性、乳化活性、乳化稳定性、起泡能力和泡沫稳定性显著增强[4]。利用美拉德反应和柑橘果胶发生糖基化反应，所得乳清分离蛋白-果胶复合物的乳化活性得到改善[5]。另外，蛋白质的糖基化反应对蛋白质的某些生物活性也有影响。例如，葡萄糖糖基化的豌豆7S球蛋白有更低的抗体亲和性，对Caco-2单层细胞的毒性和转运能力也降低[6]；乳糖糖基化的酪蛋白具有较低的体外免疫活性[7]，但晚期糖基化末端产物对人体免疫细胞具有直接的毒性作用[8]。因此，蛋白质的美拉德糖基化反应的其他不良影响，如对动物免疫状况的影响，需要进一步研究。

免疫系统是动物机体的重要防御系统，可特异性或非特异性排除侵入机体的异物。动物的免疫系统由免疫器官、免疫细胞与免疫分子组成。蛋白质是动物免疫系统和免疫反应的物质基础。蛋白质水平低或氨基酸组成不合理都会影响动物的免疫状况。蛋白质可以有效提高机体的免疫应答和特异性抗体水平，促进免疫器官发育、淋巴细胞增殖以及降低迟发性过敏反应[9-11]。然而，在正常小鼠模型中，美拉德糖基化反应对酪蛋白消化物的免疫活性是否有不良的影响或副作用，尚鲜见相关研究报道。因此，本研究利用乳糖和酪蛋白制备糖基化酪蛋白，胰蛋白酶消化制备酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物，评估糖基化酪蛋白消化物对正常小鼠免疫状况的作用，并与酪蛋白消化物作用对比，揭示美拉德糖基化反应对酪蛋白消化物免疫活性的潜在影响。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雌性BALB/c小鼠（6～8 周龄；生产许可证号：SCXK（京）2012-0001，使用许可证号：SYXK（黑）2016-007）和饲料 北京维通利华实验动物技术有限公司；小鼠淋巴瘤YAC-1细胞 中国科学院细胞库。动物实验按照哈尔滨医科大学实验动物准则执行。

酪蛋白、乳糖、刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶（比酶活力120 kU/g） 北京奥博星生物技术有限公司；台盼蓝 美国Amresco公司；RPMI-1640培养基 美国HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 加拿大Wisent公司；其他化学试剂均为分析纯。酶法测定半乳糖试剂盒 美国BioAssay Systems公司；CCK-8检测试剂盒 日本Dojindo公司；鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）（IgM、IgA、IgG）检测试剂盒 南京建成生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

DELTA 320型精密pH计、AL204型电子分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HF-90型CO2培养箱 美国力康公司；Model 680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；DXC 800自动生化分析仪 美国Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 乳糖糖基化酪蛋白消化物的制备

取一定量乳糖均匀分散于60 g/L酪蛋白溶液中，使乳糖和酪蛋白质量比为1.6∶1，调整酪蛋白终质量浓度为50 g/L、溶液pH 6.8。将反应物于沸水浴（100 ℃）中反应3 h，然后将样品在冰浴中迅速冷却至室温。调整溶液pH值至4.5，4 000×g离心10 min，收集沉淀，pH 4.5下水洗2 遍，所得沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液调至中性，冷冻干燥后粉碎得到糖基化酪蛋白（乳糖含量（13.2±0.4）g/kg pro）。

用去离子水配制质量浓度为50 g/L的酪蛋白溶液和糖基化酪蛋白溶液，调整溶液pH 7.0，然后分别加入7 kU/g pro胰蛋白酶，37 ℃水解4 h，沸水浴灭酶5 min，快速冷却至20 ℃，再用0.5 mol/L NaOH溶液调整pH 7.0，冷冻干燥粉碎后得到酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物（乳糖含量（10.6±0.3）g/kg pro）。

1.3.2 化学指标测定

蛋白含量：用凯氏定氮法测定样品含氮量，转换因子为6.38。

乳糖含量：按照文献[12]方法测定乳糖含量。称取一定量样品于安瓿瓶，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，100 ℃水解4 h，冷却至20 ℃，用0.1 mol/L NaOH溶液调整pH值至7.0，用半乳糖检测试剂盒测定水解液半乳糖浓度，然后换算为样品中的乳糖含量。

1.3.3 小鼠分组

雌性BALB/c小鼠70 只，适应性饲养1 周后，随机分为7 组：空白组和6 个实验组，每组10 只。空白组小鼠每天灌胃生理盐水，实验组小鼠每天给予3 种剂量的酪蛋白消化物或糖蛋白消化物（低、中、高剂量分别为100、200 mg/kg mb和400 mg/kg mb），持续28 d。

1.3.4 血清生化指标和免疫球蛋白分析

小鼠末次灌胃24 h后，称体质量，眼球采血。血液样品于2 000×g离心10 min，用DXC 800自动生化分析仪测定血清生化指标。收集血清样品用相应试剂盒按照说明书操作步骤测定IgM、IgA、IgG质量浓度。

1.3.5 脾脏指数和胸腺指数测定

小鼠眼球取血后，脱颈处死，剖取脾脏和胸腺，称湿质量，分别按式（1）、（2）计算脾脏指数和胸腺指数。

1.3.6 脾淋巴细胞增殖实验

无菌条件下将各组小鼠剖腹、取出脾脏，剪成小块置于200 目不锈钢网筛，筛网中央浸没于盛有Hank’s液的平皿中。无菌注射器芯研磨脾脏组织，用Hank’s液把网筛上剩余组织吹洗掉，收集脾脏组织悬液于无菌离心管，199×g下离心5 min，弃去上清液。加入3 mL红细胞裂解液重悬细胞，静置3 min，199×g离心5 min，弃去上清液；RPMI-1640培养液重悬细胞制成单细胞悬液，通过台盼蓝实验计算细胞数，活细胞比例不少于95%，调整细胞数为2×105个/mL。

将200 μL脾细胞悬液接种于96 孔板，同时加20 μL ConA（终质量浓度为5 μg/mL），置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24～48 h；加入20 μL CCK-8，继续于37 ℃培养4 h；然后用酶标仪在450 nm波长处测定光密度值。以不添加脾细胞添加RPMI-1640培养液作空白孔。脾淋巴细胞增殖指数按式（3）计算[13]。

1.3.7 自然杀伤细胞活力分析

将靶细胞YAC-1细胞用RPMI培养液（含有体积分数10% FBS）调整细胞浓度至1×104个/mL。将脾细胞悬液（5×105个/mL）和靶细胞悬液（1×104个/mL）各100 μL/孔接种于96 孔板，同时设定效应细胞和靶细胞实验孔。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24～48 h后，加入15 μL CCK-8，继续培养4 h，用酶标仪于450 nm波长处测定各孔光密度值。自然杀伤（natural killer，NK）细胞活力按式（4）计算[14]。

1.4 数据处理与分析

结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0软件中的单因素方差分析和Duncan’s多重比较法对数据进行统计分析，确定各组间数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 两种酪蛋白消化物对小鼠血清生化指标的影响

本实验中两种酪蛋白消化物对小鼠血清17 项生化指标的影响如表1所示。与空白组小鼠相比，糖基化酪蛋白消化物组小鼠血清各项指标均增加，表明糖基化酪蛋白消化物改善了小鼠生理状况。然而，与酪蛋白消化物相比，糖基化酪蛋白消化物对小鼠生理状况的改善程度要低一些，在小鼠体内糖基化酪蛋白消化物的活性低于酪蛋白消化物。这可能是由于美拉德反应破坏了蛋白质中赖氨酸等氨基酸[15-16]。因此，酪蛋白乳糖糖基化导致酪蛋白消化物在正常小鼠中的活性降低。

表1 两种酪蛋白消化物对小鼠血清生化指标的影响Table 1 Serum biochemical indices of mice in response to the two digests

对于5 项重要生化指标（总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulin，GLO）、谷丙转氨酶（alanine amiotransferase，ALT）和血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）），与空白组小鼠相比，酪蛋白消化物组小鼠血清TP质量浓度增加了9.8%～26.4%、ALB质量浓度增加了6.9%～26.0%、GLO质量浓度增加了8.1%～42.1%、ALT活力增加了11.1%～38.9%和BUN浓度增加了12.9%～29.0%。而糖基化酪蛋白消化物组小鼠血清5 项重要生化指标较空白组小鼠仅分别增加了7.9%～25.5%、6.3%～23.9%、3.4%～33.2%、7.4%～22.2%和3.2%～19.4%。两种酪蛋白消化物处理组间，灌胃剂量为100 mg/kgmb时，小鼠血清BUN浓度差异显著；灌胃剂量为200 mg/kgmb时，TP质量浓度、ALT活力和BUN浓度均差异显著；灌胃剂量为400 mg/kgmb时，ALT活力和BUN浓度差异显著。以上结果表明，酪蛋白消化物较糖基化酪蛋白消化物对正常小鼠具有更好的免疫提升效率。动物血清生化指标常用于反映实验动物的生理代谢与健康状况[17]。血清TP主要由血清GLO和血清ALB构成。TP在维持血管内胶体渗透压、运输养分等功能中具有重要作用，可反映机体本身的营养状况和对蛋白质的消化吸收情况，TP含量越高，表明机体合成蛋白质能力越强，即动物营养状况良好[18]。ALT是检测肝功能的重要指标。血清BUN为机体蛋白质和氨基酸等组分的代谢产物，是反映动物体内蛋白质代谢和氨基酸平衡状况的指标[19]。已有研究表明，膳食补充L-赖氨酸可通过影响血清生化指标调控机体免疫功能[20]。

2.2 两种酪蛋白消化物对小鼠血清中Ig分泌的影响

图1 两种酪蛋白消化物对小鼠血清IgM（A）、IgA（B）和IgG（C）分泌的影响Fig. 1 Effects of the two digests on the levels of serum IgM (A), IgA (B),and IgG (C) of mice

由图1可知，与空白组小鼠比较，酪蛋白消化物处理使小鼠血清IgM、IgA和IgG质量浓度分别增加了5.3%～29.6%、14.3%～44.5%和12.2%～31.7%，糖基化酪蛋白消化物处理使小鼠血清IgM、IgA和IgG质量浓度分别增加了3.9%～26.7%、9.9%～31.3%和2.26%～29.5%。酪蛋白消化物组小鼠与糖基化酪蛋白消化物组小鼠在灌胃剂量为200 mg/kg mb和400 mg/kg mb时，IgM质量浓度差异显著；在灌胃剂量为100、200 mg/kg mb和400 mg/kg mb时，IgA和IgG质量浓度均有统计学差异。在同一剂量水平下，酪蛋白消化物显示出比糖基化酪蛋白消化物更强的作用效果，证明酪蛋白的糖基化反应降低了酪蛋白消化物提升小鼠Ig分泌的能力。Ig是机体免疫系统的主要效应分子，由动物机体内淋巴系统B细胞产生，其含量大小直接反映动物机体免疫应答能力的高低[21]。已有研究表明，鲤鱼卵蛋白的胃蛋白酶水解物可以显著提高小鼠IgA和IgG的分泌[22]；大豆低聚糖可以增加小鼠IgM、IgA和IgG的分泌[23]；酪蛋白肽通过促进Ig产生和免疫分子分泌，实现对机体免疫功能的调控作用[24-26]。以上实验结果证明两种酪蛋白消化物均对正常小鼠血清Ig分泌具有促进作用。

2.3 两种酪蛋白消化物对小鼠免疫器官指数的影响

图2 两种酪蛋白消化物对小鼠免疫器官指数的影响Fig. 2 Effects of the two digests on immune organ indices of mice

由图2可知，与空白组小鼠比较，给予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，各剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数均显著增加（P＜0.05）。酪蛋白消化物处理导致小鼠脾脏指数和胸腺指数较空白组小鼠分别增加了21.0%～37.4%和38.2%～74.0%，而糖基化酪蛋白消化物处理导致小鼠两种免疫器官指数较空白组小鼠分别增加13.1%～28.0%和25.2%～58.5%。在同一剂量水平下，酪蛋白消化物对两种免疫器官指数的提升作用均强于糖基化酪蛋白消化物，并且均有统计学差异，证明酪蛋白的糖基化反应不利于酪蛋白消化物改善小鼠脾脏和胸腺的生长发育状况。

脾脏是动物的外周免疫器官，富含T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞，是体液和细胞免疫的中心。胸腺是动物的一级免疫器官，对T细胞成熟和分化起作用[27]。因此，脾脏指数、胸腺指数可直接反映机体免疫状况。研究表明，毛霉发酵豆制品毛豆腐及其提取物可以增加正常小鼠脾脏指数和胸腺指数，提高动物免疫状况[28]。胃蛋白酶水解薏苡仁谷蛋白后，其水解物可以增加小鼠脾脏指数和胸腺指数，提高动物免疫状况[29]。本实验结果与这些研究的结论一致。

2.4 两种酪蛋白消化物对小鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞活力的影响

图3 两种酪蛋白消化物对小鼠淋巴细胞增殖和NK细胞活力的影响Fig. 3 Effects of the two digests on lymphocyte proliferation and NK cell activity in mice

由图3可知，两种酪蛋白消化物以剂量依赖方式促进小鼠脾淋巴细胞增殖和增强NK细胞活力。与空白组小鼠相比，酪蛋白消化物处理组小鼠脾淋巴细胞增殖指数和NK细胞活力分别提高了5.9%～42.0%和23.4%～63.0%，而糖基化酪蛋白消化物处理组小鼠仅分别提高了4.5%～36.2%和13.5%～53.4%。两种酪蛋白消化物处理组小鼠相比，在灌胃剂量100 mg/kg mb时，仅NK细胞活力有统计学差异；在灌胃剂量200 mg/kg mb和400 mg/kg mb时，脾淋巴细胞增殖指数和NK细胞活力均有统计学差异。因此，糖基化酪蛋白消化物刺激小鼠脾细胞增殖的能力低于酪蛋白消化物，再次证明糖基化反应降低了酪蛋白消化物提升小鼠免疫细胞活性的作用。

脾淋巴细胞是机体内重要的免疫细胞，其增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，通过对淋巴细胞增殖作用的评估可以间接证明动物机体的免疫水平[30]。NK细胞是重要的免疫效应细胞，与机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关[31]。已有研究结果表明，乳蛋白肽可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖和提高NK细胞活力[32]。胃蛋白酶水解鲤鱼卵蛋白后，其水解物显著提高了小鼠脾淋巴细胞增殖作用和NK细胞活力[22]。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合水解乳清分离蛋白，其消化物均具有增强小鼠脾淋巴细胞增殖的作用[33]。这些结论为本实验结果提供了科学依据。

3 结 论

本研究通过评估正常小鼠的17 项血清生化指标、3 种血清Ig质量浓度、脾脏指数、胸腺指数、淋巴细胞增殖指数、NK细胞活力等重要免疫学指标，明确了酪蛋白的美拉德乳糖糖基化反应对酪蛋白消化物的不利影响。实验结果表明，正常小鼠分别给予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，虽然免疫状况均得到提升，各指标数值增加，但酪蛋白消化物具有比糖基化酪蛋白消化物更好的免疫提升效率。因此，本研究结果揭示酪蛋白的美拉德乳糖糖基化反应对酪蛋白消化物的体内免疫提升活性有不良影响。考虑蛋白质的美拉德糖基化反应可能降低蛋白质消化物的免疫活性，而乳品加工过程中乳蛋白和乳糖之间的美拉德反应不可避免，因此，控制乳制品加工处理过程中的美拉德反应具有重要意义和必要性。