无创产前基因检测在性染色体非整倍体产前筛查中的应用

黄婷婷，卢婉，刘艳秋

(江西省妇幼保健院产前诊断中心，江西 南昌 330006)

临床常见性染色体非整倍体(sex chromosomal aneuploidies，SCA)主要包括 45，X(Turner综合征)、47，XXY(克氏综合征)、47，XXX(超雌综合征)及 47，XYY(超雄综合征)等[1]。SCA患者临床表型多样，有些患者可终生没有异常表型,而有些可表现为身高发育异常、器官结构异常、智力低下或精神及神经功能障碍、第二性征发育不良致不孕不育等。传统的血清学筛查方法不能筛查SCA,而产前诊断技术（羊膜腔穿刺、绒毛活检以及脐静脉穿刺）具有一定的创伤性,有感染、出血、流产、胎儿损伤等风险。随着高通量测序技术的发展,通过无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)对胎儿 SCA 的产前筛查得到广泛应用。本研究通过对2016年1月至2018年1月在本中心行NIPT的20334例孕妇中筛查的SCA阳性病例进行回顾性分析，计算阳性预测值 （positive predictive value,PPV），探讨NIPT技术对检测胎儿SCA的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2016年1月1日至2018年1月31日在江西省妇幼保健院产前诊断中心行NIPT的20334例孕妇,排除标准参照国家卫生和计划生育委员会《孕妇外周血游离胎儿DNA产前筛查与诊断技术规范》。NIPT筛查SCA阳性的76例孕妇检测结果提示为性染色体数目增多或减少。分析NIPT筛查SCA阳性孕妇检测指征并进行详细的遗传咨询,在知情同意下行介入性产前诊断（抽取羊水或脐血）,行G显带核型分析及荧光原位杂交，对诊断结果进行分析，本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 NIPT⑴标本采集 采集孕妇外周血5ml,于4℃条件下，1600g，离心10min，吸取上清置入离心管，再16000g，离心10min，二次分离以清除血浆内的残余细胞。⑵)胎儿游离DNA提取：严格按照核酸提取试剂盒的说明书（磁珠法）提取游离DNA，再经过末端修复、接头连接、PCR构建DNA文库，并用Qubit对文库进行定量。⑶DNA测序：选用胎儿染色体非整倍体试剂盒（T21，T18，T13）以高通量测序仪BGISEQ-500检测孕妇外周血游离DNA。将每条DNA片段测序所得的序列与人类基因组进行比对，通过生物信息学分析，计算胎儿患性染色体非整倍体疾病的风险值。

1.2.2 羊膜腔或脐血穿刺 对NIPT筛查SCA阳性孕妇进行详细的遗传咨询,在充分知情同意下行介入性产前诊断。对孕16～24周孕妇行羊膜腔穿刺抽取羊水20ml，孕24周以上孕妇行脐静脉穿刺抽取脐血2.5ml,备用。电话随访未行介入性产前诊断的孕妇，随访内容包括妊娠结局，及胎儿出生时情况。

1.2.3 G显带核型分析 将获取的羊水或脐血按照常规方法进行细胞接种、培养、收获、制片和G显带，利用Leica全自动染色体分析系统进行中期细胞的扫描和图像采集，由2位有资质的人员阅片，分析5个核型，计数20个核型，遇到嵌合型染色体时增加计数至50个或以上,最后出具诊断报告。

1.2.4 荧光原位杂交 将获取的羊水或脐血按照常规方法进行细胞处理、玻片处理、杂交、洗片、复染,杂交玻片置于荧光显微镜下观察分析，出具报告。

1.3 统计学方法 用Excel表格收集数据。正态分布计量资料用±s)表示；计数资料用频数、率或构成比表示。

2 结果

2.1 筛查SCA阳性病例的NIPT指征 共20344例孕妇行NIPT，筛查SCA阳性孕妇76例，其中孕妇的最大年龄是47岁,最小年龄是17岁,平均年龄（32.5±5.0）岁。主要指征唐筛21三体高风险31例（40.8%），唐筛 18三体高风险 3例（3.9%），孕中期AFP 值偏低 1例（1.3%），高龄 29例 （38.2%），无明显指征12例（15.8%）。见表1。

表1 20344例孕妇行NIPT的指征

2.2 NIPT筛查SCA阳性与核型分析及荧光原位杂交结果比较 筛查SCA阳性孕妇76例,其中NI PT提示性染色体减少39例，28例孕妇行介入性产前诊断，8例核型分析异常；性染色体数目增多37例，24例孕妇行介入性产前诊断，17例核型分析异常。见表2。

表2 NIPT筛查SCA的阳性预测值

2.2.1 NIPT提示性染色体数目减少结果分析NIPT提示性染色体减少39例，经遗传咨询，27例孕妇行羊膜腔穿刺，1例孕妇因孕周较大行脐静脉穿刺。20例核型分析及荧光原位杂交结果正常，3例为 XO，1例 47,XXX[32]/45,X[17],1例 45，X[19]/46,X,i(X)（q10）[35],1 例 45，X[7]/46，X，Yqh-[43],1例45，X[22]/46，XY[28],1例荧光原位杂交结果正常，但核型分析结果为46，X,del(X)(p21),t(9;17)(q12;q21)pat，电话随访均引产。另1例孕妇未行介入性产前诊断直接引产，7例孕妇拒绝进一步诊断，3例孕妇失联。见表3。

表3 NIPT提示性染色体数目减少结果分析

表4 NIPT提示性染色体数目增多结果分析

2.2.2 NIPT提示性染色体数目增多结果分析NIPT提示性染色体数目增多37例，经详细的遗传咨询，22例孕妇行羊膜腔穿刺，2例孕妇因孕周较大行脐静脉穿刺。7例核型分析及荧光原位杂交结果正常,另7例47,XXY,7例47XXX,2例47,XYY,1例47，XXX[8]/46，XX[41]。结果正常及2例羊水提示胎儿47，XXX及47XYY孕妇选择继续妊娠，电话随访胎儿出生时正常，余孕妇选择终止妊娠。见表4。

3 讨论

出生缺陷是影响儿童健康的主要公共卫生问题，且影响新生儿的生活质量。染色体异常是最严重的出生缺陷之一，由于缺乏有效治疗，染色体异常往往引起严重胎儿损伤。SCA患儿临床表现差异较大，可能会造成胎儿生殖器官发育异常、智力发育障碍、生长发育异常、心肾障碍等情况[2]，早期干预如物理治疗、对症治疗和个性化教育等可明显改善SCA患儿的预后。但性染色体异常致死致残率较低，通过B超检查基本难以发现，有创产前诊断是临床应用的有效方法,不过孕妇的接受度不高，故胎儿SCA的早期筛查显得尤其重要。

近年来，NIPT技术已广泛应用于常染色体非整倍体的产前筛查[3,4]。大量文献[5,6]肯定NIPT在孕妇产前筛查中的作用，但在筛查13、18、21号染色体以外的其他染色体非整倍体性改变时，该技术的灵敏度及准确性还有待进一步的提升[7]。如NIPT对胎儿SCA的产前筛查时,检出率有较大差异[8]。Bin Yu等[9]通过大规模平行基因组测序筛查胎儿SCA的总PPV为54.54%。Zhang等[10]研究中,10275例孕妇行NIPT，SCA筛查阳性率为0.55%，总PPV为54.54%,其中45,X的PPV仅为29.41%，47,XXY的PPV为77.78%，47,XXX及47,XYY的PPV均为100%。本研究使用高通量大规模平行基因组测序技术筛查胎儿SCA的总PPV为48.1%，其中性染色体减少的PPV为28.6%,性染色体增多的PPV为70.8%,与贾颐舫等报道一致[11]。不同研究中NI PT筛查SCA的PPV不同，主要是由于纳入研究的样本量及测序深度不同等所致。

细胞游离DNA来源于母体及胎盘组织，因此母体嵌合现象、未确诊的母体SCA、母体拷贝数失衡、胎儿染色体嵌合体等可影响NIPT筛查胎儿SCA的准确性[12,13]。胎儿游离DNA主要来源于胎盘滋养层细胞，其核型常为嵌合，嵌合的程度及母亲体重均会影响NIPT检测的性能。本研究中NIPT筛查性染色体数目减少的阳性预测值偏低的主要原因是：⑴X染色体上有1098个基因，Y染色体上有78个基因,其中58个基因是这两条染色体上的同源基因，这些同源基因中的29个基因位于X染色体和Y染色体的末端。⑵目前的测序长度只有36个底座，故容易导致X染色体和Y染色体测序定位错位。⑶胎盘组织中来源于父亲的X染色体更易发生随机失活导致NIPT筛查性染色体数目减少的阳性预测值偏低[14]。

在本研究中,有24例NIPT筛查的高危SCA患者拒绝接受进一步的核型分析。临床上，遗传医师应客观地向孕妇及家属解释NIPT筛查SCA的准确率及局限性，不应盲目夸大NIPT的作用,且对胎儿可能出现的性染色体异常的预后进行遗传学咨询。另25例已确诊的胎儿SCA孕妇中23例选择引产。SCA不属于严重的致死、致残或致愚疾病，其妊娠选择往往受到医生遗传咨询方法、家庭的社会经济水平、受教育程度、文化背景、孕妇对疾病的认识和接受程度等多种因素的影响[15]。当产前筛查或诊断为胎儿SCA时,不仅对临床医生遗传咨询提出了挑战,更使孕妇妊娠选择处于两难境地。

综上所述，NIPT可用于性染色体非整倍体产前筛查，但阳性预测值不高，需要进一步完善检测技术和分析方法，以提高检测准确率。