胃癌患者循环肿瘤细胞与凝血功能及预后的研究

杨 汉 陈怡璋 崔笑雯 陈 楠 汤翠菊

胃癌是世界上第四大最常见的恶性肿瘤，也是第二大癌症死亡原因[1]。几乎三分之二的病例发生在发展中国家，其中42%发生在中国。大部分胃癌患者在确诊时已是晚期。循环肿瘤细胞(CTC)作为预测总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、复发风险和化疗有效性的生物标志物，一直受到临床医师的关注。在恶性肿瘤患者中，大约一半的患者表现为凝血功能异常。高凝状态是癌症患者发生血栓的重要危险因素，并可能在疾病进展中发挥作用。本文就胃癌患者CTC水平与凝血指标及预后的关系进行研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年9月至2017年9月在南京市第一医院收治的103例经病理证实的胃癌患者。其中男性74例，女性29例，年龄40～80岁，平均年龄66.2岁。62例患者行根治性胃切除术，30例患者行姑息性胃切除术，10例患者行剖腹探查术，1例患者未经手术。纳入标准：①患者年龄至少为18岁但不超过80岁；②经病理证实患有胃癌；③患者之前未接受过新辅助放化疗。排除标准：①处于怀孕、哺乳或生育期；②诊断患有其他肿瘤；③有血栓栓塞、家族性凝血障碍、严重感染或弥散性血管内凝血病史；④手术前1个月内接受过抗凝或抗血小板聚集治疗；⑤合并心、肝或肾功能不全患者。所有患者在手术后均根据NCCN指南进行治疗，随访至2018年9月31日。所有患者均签署书面知情同意书。

1.2 检测方法

胃癌患者于手术前2天采集静脉血样本。采用SF-8100全自动凝血测试仪测定凝血四项水平。使用迈瑞BC6800全自动血液分析仪检测PLT。采用阴性免疫磁微粒法和荧光原位杂交法检测CTC，具体如下：准备CS1工作液(1×)、CS2工作液(1×)、CS3分离介质、抗CD45磁微粒混悬液等，平衡至室温。充分混匀一次性真空采血管中的全血样本，取4 ml全血至50 ml离心管中。用CS1冲洗标本管管壁，将离心管内的体积补充到45 ml。离心，吸去上清，留12 ml于离心管，轻摇离心管混匀沉淀细胞。混匀后加入CS2至45 ml。将离心管置于垂直混匀仪混匀，室温8～10 min(20 rpm)。离心(650 g，室温，5 min)，吸弃上清吸干，加300 μl的CS2。竖直离心管，沿水平方向摇匀，补加5 ml CS1。建议按量取用CS2。吸取适量磁微粒混悬液至2 ml离心管中，置于磁力架上1 min左右。待溶液澄清后，吸弃澄清溶液。重复3次后按每份150 μl的剂量缓慢加入离心样本中，充分混匀20 min。移动到装有3 ml CS3的离心管内，配平后离心(300 g，室温，5 min)。吸取最上两层溶液于15 ml离心管中，补加CS1至14 ml，离心(950 g，室温，5 min)，弃上清至约300 μl，沿管壁加入1 ml CS1，轻柔吹打重悬沉淀细胞。将标本转移至2 ml离心管中，置于磁力架上，室温2～3 min，将上清转移至1.5 ml离心管中。将1.5 ml离心管架于15 ml离心管上端，水平离心(2070 g，室温，3 min)，弃上清至约100 μl，加入CF1固定液100 μl，充分轻柔吹打混匀10次以上，涂片至(20×20)mm2的免疫组化标本框中，自然干燥标本。免疫荧光染色：按每人份20 μl抗人CD45-AF594荧光抗体，加入180 μl 2% BSA溶液的比例，配制抗体工作液，混匀，避光待用。用0.2% BSA清洗标本区2次。吸去标本片上的0.2% BSA，将配制好的抗体加至标本区，室温下避光孵育1～1.5 h。用0.2% BSA清洗标本区2次，DAPI复染，盖片。使用生物荧光显微镜沿“S”轨迹观察载玻片，并且利用装有TCapture软件的电荷耦合器件(CCD)相机(TucsenH694C)观察全片，进行图像分析。联合CD45、DAPI、CEP8和CD17的染色数据来进行CTC计数。试剂盒规定CTC 数目≥2个为CTC阳性。

1.3 观察指标及评测标准

CTCs阳性的判断标准。根据CEP8、CEP17的表达状态分为3类异常细胞：DAPI+/CD45-/CEP8=2/CEP17>2(8号染色体信号点两个，17号染色体信号点多于2个)，或DAPI+/CD45-/CEP17=2/CEP8>2(17号染色体信号点两个，8号染色体信号点多于2个)，或DAPI+/CD45-/CEP8>2/CEP17>2(8号和17号染色体信号点均超过2个)。以上3类异常细胞均纳入CTC计数。CTC数目≥2个为CTC阳性。

各凝血指标的正常范围：APTT：9～13 s；PT：24～32.8 s；FIB：2～4 g/l；TT：14～21 s；D-D：0～0.5 mg/l；PLT：125～350×109。

1.4 统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据如符合正态分布，采用均数±标准差表示计量资料(如不符合则选用中位数)，t检验或单因素方差分析进行组间比较(如不符合则选用两样本或多样本秩和检验)。比较胃癌患者临床特征和凝血指标的关系。将CTC按数目分为CTC阳性和CTC阴性两组，使用Logistics分析D-D、PLT对CTC。采用Cox回归模型进行多因素分析各变量与胃癌预后的关系。采用Kaplan-Meier方法计算不同CTC水平下患者的生存曲线，并通过Log-rank检验确定P值。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 凝血指标和临床特征的相关性

在本研究中，6项凝血指标(D-D数据不满足正态分布，其余均满足)均不受患者年龄、性别、肿瘤原发部位影响，差异均无统计学意义(P>0.05)。不同分化程度、TNM分期以及远处转移状态的患者之间D-D、PLT水平的差异均有统计学意义(P<0.05)。FIB水平可能与远处转移状态有一定关系，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 患者临床特征与凝血指标的关系

2.2 胃癌患者CTC与凝血指标的关系

在103例胃癌患者中，共有CTC阴性(<2)41例，CTC阳性(≥2)62例。对6组凝血指标进行t检验，结果提示在CTC阳性组中D-D、PLT水平明显高于CTC阴性组(P<0.05)，其余各项指标均无统计学意义，提示D-D、PLT和CTC可能存在一定联系，见表2。

表2 胃癌患者CTC与凝血因子的关系

以D-D、PLT两项指标为自变量，CTC阳性(≥2)为因变量(阳性赋值为1，阴性赋值为0)，使用logistics回归方法计算两组数据与CTC阳性率的关系，结果D-D、PLT均纳入回归方程中(P<0.05)，OR为3.95和1.01，提示CTC阳性率与D-D、PLT均有明显关系，见表3。

表3 D-D、PLT的二元logistics回归分析

2.3 胃癌患者CTC与预后的关系

随访时间至2019年7月30日，研究结束时共计43例(41.9%)患者死亡。以月(m)为时间单位。中位随访时间为16.3 m，中位OS为24 m(95%CI:15.1～32.9 m)。根据CTC状态分层，CTC阴性的患者的中位OS为35.7 m(95%CI:32.5～38.9)，CTC阳性患者的中位OS为16.5 m(95%CI:8.31～12.97)。不同CTC状态患者的OS差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。采用Cox回归模型进行的多因素生存分析表明，血浆D-D水平是胃癌患者生存的独立危险因素(HR=2.369，95%CI:1.704～3.293，P<0.05)。见表4。

表4 CTC、D-D、PLT的Cox回归分析

图1 胃癌患者不同CTC状态的Kaplan-Meier曲线

3 讨论

肿瘤患者常伴有凝血功能紊乱及血栓[2]。凝血过程中纤溶激活系统在肿瘤的浸润、转移中起着重要作用。肿瘤细胞分泌的尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)产生纤溶酶，纤溶酶催化降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤浸润和肿瘤细胞进入循环系统[3-4]，提示循环肿瘤细胞可能与凝血系统存在一定联系。

组织因子(TF)是1种跨膜糖蛋白，与膜磷脂共同参与血液高凝的发生过程。一般情况下，只有当血管结构受到破坏，血液暴露在血管外时，血液中的凝血因子与血管外表表达TF的细胞接触才会激活凝血系统。而在肿瘤转移过程中，血液中TF表达阳性的循环肿瘤细胞(CTC)可促进凝血酶的生成和纤维蛋白的生成，从而导致病理性血栓的形成。Lee等通过建立CTC及凝血酶浓度梯度的数学计算模型，发现CTC在血流中的空间分布决定了局部凝血酶的浓度，证明了CTC对血液高凝状态的促进作用[5]。Wang等发现血小板可被骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)和癌细胞激活，而活化的血小板增强了BM-MSCs促进癌细胞转移的能力[6]。Diao等分析了41例晚期原发性胃癌患者的血浆D-D水平和CTC值，发现D-D水平与CTC数呈线性相关(R2=0.688，P<0.001)[7]。D-D虽不能促进CTC的转移，但其作为凝血过程中稳定的最终产物能准确的反映血液高凝状态。可见血液高凝状态也能促进CTC的转移。在本研究中103例胃癌患者中发生远处转移的患者有42例，其中CTC阳性的患者有34例，CTC阳性率为80.95%，明显高于无远处转移患者(阳性率32.79%)，差异有统计学意义(P<0.05)。证明CTC水平的升高可能促进了胃癌的转移。Logistics回归分析，D-D、PLT水平与CTC的阳性率有密切关系，进一步说明D-D、PLT水平的升高即血液高凝状态可能促进了CTC在其他器官的种植、侵袭和转移。

近年来有大量研究证实CTC的检测对胃癌患者的预后有重要意义[8-10]。Wang等对胃癌患者的19项CTC研究进行了荟萃分析，提示患者CTC阳性与更短的总生存期有关(HR=2.42，95%CI:1.94～3.02，P<0.001)[11]。Okabe等在一项针对136名Ⅰ～Ⅳ期胃癌患者的研究报告，CTC阳性的患者的无进展生存期明显短于CTC阴性的患者(P=0.016)[12]。本研究使用Kaplan-Meier分析显示对于未经治疗的胃癌患者不同的CTC状态，患者的OS有显著差异(P<0.05)。同样，血液高凝状态也是肿瘤患者预后不佳的标志。Sorensen等指出，同时诊断有癌症和静脉血栓的患者的一年生存率为12%，而未诊断为血栓的患者的一年生存率为36%[13]。Liu等分析了247例胃癌患者和220例健康志愿者的D-D指标和临床病理特征，发现高水平的D-D与胃癌患者的腹膜转移和生存时间缩短有关[14]。采用Cox回归模型的多因素分析进一步表明，D-D水平是胃癌患者预后的独立预测因素。D-D水平≥0.5 mg/l的胃癌患者死亡的可能性是D-D水平低于该临界值(<0.5 mg/l)患者的2.37倍。

本研究的不足之处在于：样本量较少，对统计结果有一定影响，未对患者进行长期随访，后续仍需进一步扩大样本量，完善随访数据。未检测患者抗凝或抗肿瘤治疗后凝血指标及CTC计数的变化，故无法探讨治疗对凝血指标及CTC计数的影响。今后将设计更全面的临床试验方案，更全面地研究血液高凝状态、CTC和肿瘤转移及预后之间的关系。

综上所述，胃癌患者血液高凝状态与分化程度、TNM分期以及远处转移状态有关并可能对CTC的转移有促进作用。治疗前检测CTC指标对预测胃癌患者的预后有重要意义。