温度对红曲菌以荞麦为基质固态发酵产色素的影响

熊小倩，谌 雪，高梦祥

（长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025）

0 引言

红曲菌也叫红曲霉[1]，为真菌门子囊菌纲真子囊菌亚纲红曲霉属，在我国已经有1 000多年的历史，红曲米是由红曲菌接种在大米上的发酵产品。红曲菌发酵能产生对人体有益的多种代谢产物，如麦角甾醇能促进肌体对Ca，P的吸收，利于骨骼的生长[2-3]；γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA） 具有降低血压、镇静安神、促进睡眠、增强记忆力等功能[4]。其中，洛伐他汀能抑制细胞内胆固醇合成，具有降脂的功效[5]。红曲色素作为一种天然的食品着色剂，具有抗癌、降血糖、降血脂等多种生理活性，也是我国近年来增长速度最快的天然食用色素，在食品、化妆品、医药等多领域具有广泛的应用前景[6-7]。

荞麦是蓼科荞麦属作物，富含高质量蛋白质，赖氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量较其他谷物丰富，也富含黄酮类、植物甾醇、肌醇等功能成分[8]，其中，黄酮类化合物具有降血糖和血脂、抗癌防癌、抗氧化、清除自由基、类雌激素等生理功能，已成为荞麦研究的又一热点[9]。

试验利用荞麦的营养成分，同时发挥红曲菌的功能，制备出兼备二者功能的产品为目的，研究发酵温度对固态发酵红曲荞麦品质的影响，测定红曲色素的产量和黄酮含量的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

紫色红曲菌（Monascus pupureus），长江大学生命科学学院实验室提供。

1.1.2 培养基

（1） 察氏酵母提取粉琼脂培养基（CYA）。硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钾0.5 g，七水硫酸镁0.5 g，七水硫酸亚铁0.01 g，酵母浸膏5 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L。

（2）荞麦培养基。根据发酵条件加入20 g荞麦和9 mL去离子水，于121℃下高温高压灭菌30 min，冷却。

1.1.3 主要药品与试剂

乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、三氯乙酸，以上均为分析纯；甜荞麦、芦丁标准品、硝酸钠、氯化钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、酵母浸膏、蔗糖、琼脂。

1.1.4 试验设备与仪器

分析天平、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、恒温培养箱、水浴锅、紫外可见分光光度计、电热鼓风干燥箱、粉碎机、超声波清洗机、显微镜等。

1.2 试验方法

1.2.1 红曲荞麦的发酵制备

（1）红曲菌的培养。超净工作台紫外杀菌30 min，接种环先高温高压灭菌；采用70%左右酒精进行手部杀菌；用灭菌后的铁环刮取适量红曲菌涂抹于CYA培养基上，接种环、红曲菌种瓶口和需要接种的培养基瓶瓶口在使用前和使用后都需要在酒精灯灼烧灭菌。接种后，将培养基放置在恒温培养箱中，于30℃下培养7 d。

（2） 孢子悬液的制备。超净工作台紫外杀菌30min，有玻璃珠的锥形瓶、过滤纸、漏斗、装有去离子水的锥形瓶等进行高温高压灭菌；采用70%左右酒精消毒，无菌条件下，将已长好的菌株用无菌水冲洗，刮下来，过滤后转入装有玻璃珠的100 mL锥形瓶中，振荡并摇匀。无菌条件下，取50μL孢子液于2 mL离心管；从离心管中取10μL，用血球计数板在显微镜下数孢子，平行数3组。

（3）发酵培养。称取20 g荞麦于锥形瓶中，加入9 mL蒸馏水，用高压灭菌锅于121℃下灭菌30 min，取出冷却；在超净工作台进行，无菌操作，将1.2 mL孢子液即4.8×107个孢子接种到荞麦培养基中，振荡，分别置于不同温度（26，28，30，32，34℃）条件下恒温培养12 d；分别测定时间为2，4，6，8，10，12 d的发酵样品中色价、生物量和黄酮含量，平行做3组。

1.2.2 生物量的测定

将红曲荞麦烘干后，取1.0 g干燥培养物，适当粉碎后，取红曲荞麦粉0.2 g于50 mL离心管中，加入5%三氯乙酸25 mL，于80℃水浴条件下加热25 min，期间不断搅拌，冰水浴冷却，以转速8 000 r/min于4℃条件下离心15 min。以未发酵的固态培养基作空白对照。

在波长260 nm处测定提取液的吸光度，由所测OD值对照纯菌体与核酸紫外吸收曲线关系，换算成菌体生物量[10]；其方程为Y=5.882X+0.041 5，相关系数R2=0.993，其拟合效果较好，因此该标准曲线可用。

1.2.3 总黄酮的测定

取2 g红曲荞麦，烘干后适当粉碎，将红曲荞麦粉和70%乙醇以料液比1∶40进行超声波萃取。超声清洗机在50℃，100%功率条件下超声清洗40 min，过滤后弃去初滤液。取1 mL滤液置于25 mL容量瓶，加入30%乙醇12.5 mL，再加入质量浓度48 g/L亚硝酸钠0.7 mL，摇匀，静置5 min；再加入质量浓度91 g/L硝酸铝0.7 mL，摇匀，静置6 min，最后加浓度1 mol/L氢氧化钠5 mL，定容至25 mL，摇匀，静置10 min。以未加待测液的溶液作对照，采用721型紫外分光光度计于波长510 nm处测定OD值，可得到以芦丁为标样的总黄酮含量[11]。

绘制芦丁标准曲线时，准确称取0.013 2 mg芦丁标准品于50 mL容量瓶溶解，30%乙醇定容至50 mL。分别吸取1，2，4，6，8 mL的0.263 mg/mL芦丁标准溶液于25 mL容量瓶中，加入30%乙醇12.5 mL，加入48 g/L亚硝酸钠溶液0.7 mL，5 min后再加入91 g/L硝酸铝溶液0.7 mL，6 min后，加入浓度1 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，定容放置10 min，以未加芦丁标准溶液的样品为空白，于波长510 nm处测定其吸光度。以芦丁质量浓度为纵坐标、吸光度为横坐标，绘制标准曲线[12]。其方程为Y=4.441 1X-0.002 9，相关系数R2=0.999，其拟合效果较好，因此该标准曲线可用。试验测得原始荞麦吸光度为0.069，由标准曲线可得原始荞麦中总黄酮含量为3.04±0.15 mg/g。

1.2.4 色价的测定

取红曲霉三角瓶培养的红曲荞麦2 g，干燥后适当粉碎，将红曲荞麦粉和75%乙醇以料液比1∶6置于50 mL离心管内，在60℃恒温水浴锅加热浸提1 h，不断搅拌，冷却至室温，以转速1 300 r/min离心5 min，取上清液稀释一定倍数，根据颜色适当稀释，采用紫外分光光度计测定波长410，465，500 nm处的吸光度，再乘以稀释倍数，即得到黄、橙、红色素色价[13]。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中温度对红曲生物量的影响

发酵过程中温度对红曲生物量的影响见图1。

图1 发酵过程中温度对红曲生物量的影响

从图1可以看出，在发酵的前6 d，生物量随着发酵温度的升高而增大；6 d之后，30℃条件下生长量增长最快。到发酵结束的第12天时，生物量从高到低对应的发酵温度为30，32，28，34，26℃，即呈现出以30℃为峰值的抛物线规律。这一规律与温度影响微生物生长的普遍规律一致。这是由于生长代谢和繁殖都有酶的参加。根据酶促反应的动力学来看，温度升高，反应速度加快，呼吸强度增加，最终导致细胞生长繁殖加快。但随着温度的上升，酶失活的速度也越快，使衰老提前、发酵周期缩短，对发酵生产产生不利影响。

2.2 发酵过程中温度对红曲菌产色素的影响

红曲菌在以荞麦为基质固态发酵过程中，对温度红曲菌代谢生产黄、橙、红色素的影响。

发酵过程中温度对红曲黄色素的影响见图2，发酵过程中温度对红曲橙色素的影响见图3，发酵过程中温度对红曲红色素的影响图4。

图2 发酵过程中温度对红曲黄色素的影响

图3 发酵过程中温度对红曲橙色素的影响

图4 发酵过程中温度对红曲红色素的影响

由图2～图4可知，黄、橙、红色素的变化趋势一致，都呈现出随着发酵时间的延长，产量逐渐升高。而且表现出发酵4 d后产生色素，3种色素的色价在30℃条件下都增长最快。结合生物量随温度的变化规律，发酵温度的控制策略采取在发酵的0～4 d于34℃下培养，发酵4～12 d进行30℃的培养。

2.3 发酵过程中温度对荞麦基质中黄酮含量的影响

发酵过程中温度对荞麦基质中黄酮含量的影响见图5。

图5 发酵过程中温度对荞麦基质中黄酮含量的影响

由图5可知，荞麦基质的黄酮含量总体变化不显著。在各温度下均呈现出相似的规律，发酵后期黄酮含量略有下降。可能是红曲菌以荞麦中包括黄酮在内的其他成分为养分所导致。

3 结论

试验以荞麦为红曲菌的固态发酵基质，以红曲色素为试验指标，探讨了发酵温度对红曲荞麦中红曲色素及总黄酮类物质的影响规律，为开发具有红曲色素活性功能的荞麦提供了一条新思路。