头穴透刺对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力及海马NR1、NR2B受体mRNA表达的影响

蒋凌飞 ，黄庆嘉，陈 炜，范郁山，赵彩娇

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种神经系统退行性疾病，临床特征以记忆障碍、失认、失用、人格、行为等改变为主，是痴呆最常见的一种类型。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体是离子型谷氨酸受体的一种亚型，在神经系统的发育、神经细胞存活、凋亡等多种生理过程发挥重要作用[1]。研究发现，NMDA受体与学习记忆障碍类疾病密切相关，在AD发病的众多环节中起关键作用[2]。本实验通过观察头穴透刺对AD模型大鼠学习记忆能力及大鼠海马NR1、NR2B受体mRNA表达的影响，探讨头穴透刺治疗AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取2月龄SPF级Wistar雄性大鼠60只，体质量(200±50)g，由广西医科大学实验动物中心提供(动物生产许可证号：SCXK桂2009-0002)。

1.2 实验药品及试剂 焦碳酸二乙酯(DEPC)、Trizol试剂、2 000 bp DNA Marker试剂盒、TRIzol试剂盒，购于Invitrogen公司(美国)；盐酸美金刚片(批号：H20120268，丹麦灵北药厂生产)、链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)、10%水合氯醛等。

1.3 主要器材和设备 脑立体定位仪、Morris水迷宫实验系统、无菌针灸针、普通聚合酶链式反应(PCR)仪、精密天平、pHS-3B/3C/2C/25性酸度计、Unico紫外光分光光度计、ABI7500荧光定量PCR、电针治疗仪、光学显微镜等。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模 用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，参照《大鼠脑立体定位图谱》[3]，将大鼠固定于脑立体定位仪上，在前卤后1.5 mm、矢状缝侧方1.5 mm处钻孔，微量进样器注射STZ 3 mg/kg，于手术的第1天和第3天分别两次向侧脑室注射[4]。

1.4.2 实验分组及处理 60只Wistar大鼠，实验第1天经水迷宫测试，排除先天愚笨者。随机分为假手术组10只、空白组10只，剩余40只制备AD大鼠模型，造模14 d后，采用Morris水迷宫对大鼠模型进行筛选，选取AD造模大鼠30只，将AD模型大鼠随机分为模型组、针刺组、西药组，每组10只。造模20 d后进行治疗，7 d为1个疗程，连续治疗4个疗程，治疗结束后，对各组大鼠再次进行Morris水迷宫测试。假手术组：按照动物造模方法将侧脑室注射生理盐水；空白组：常规饲养；模型组：常规造模；针刺组：俯卧位将大鼠固定在操作台上，沿“神庭”至“上星”方向透刺双侧“百会”至“太阳”方向透刺，均沿皮刺入6 mm，7 d为1个疗程，连续治疗4个疗程；西药组：予盐酸美金刚片10 mg/(kg·d)灌胃治疗，7 d为1个疗程，连续治疗4个疗程。

1.4.3 灌注取材 用体积分数10%水合氯醛(3 mL/kg)进行腹腔注射麻醉大鼠后，固定在手术台上，快速开胸暴露心脏。用粗针头经左心室插入升主动脉，剪开右心耳，用0.9%氯化钠液250 mL快速滴入，冲洗组织内血液，立即断头取脑，分离出海马组织，放入液氮罐内保存。

1.5 检测指标

1.5.1 大鼠记忆能力检测 分别于造模前、造模后及治疗后进行3次水迷宫测试，并记录各组大鼠空间探索实验跨越平台的次数与定位航行试验逃避潜伏期。

1.5.2 荧光定量PCR法检测NR1、NR2B受体mRNA相对表达量 按照Trizol试剂 RNA提取法抽提各组海马组织mRNA，按照操作说明进行转录，引物序列(5′→3′)：内参RNA β-actin，下游CCTGTGGCATCCATGAAACTAC，上游 GCTAGGAGCCAGGGCAGTAA；NR1，下游GGGCTTGCTCTACCACTCTT，上游GCTTTTGCAGCCGTGAAC；NR2B，下游GCTCCAAAGCCCCATCATT，上游AGGCACCGTGTCCGTATCC。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，PCR反应95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共45个循环。反应结束后，以β-actin的Ct值为内参，使用2-△△Ct相对定量计算公式计算NR1、NR2B受体相对mRNA表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠学习记忆能力比较

2.1.1 定位航行试验逃避潜伏期实验结果 造模前各组大鼠逃避潜伏期比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模后模型组、西药组、针刺组逃避潜伏期较空白组、假手术组明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，西药组、针刺组逃避潜伏期较造模后缩短(P<0.05)，且与模型组、空白组、假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组定位航行试验逃避潜伏期比较(±s) 单位：s

与空白组同时间比较，①P<0.05；与假手术组同时间比较，②P<0.05；与模型组同时间比较，③P<0.05；与同组造模后比较，④P<0.05。

2.1.2 空间探索实验跨越平台次数结果 造模前各组大鼠跨越平台次数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模后模型组、西药组、针刺组跨越平台次数明显减少，与空白组、假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。经治疗后，西药组、针刺组跨越平台次数较造模后增加(P<0.05)，且与模型组、空白组、假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组空间探索实验跨越平台次数比较(±s) 单位：次

与空白组同时间比较，①P<0.05；与假手术组同时间比较，②P<0.05；与模型组同时间比较，③P<0.05；与同组造模后比较，④P<0.05。

2.2 各组大鼠海马NR1、NR2B受体mRNA表达量比较 模型组NR1、NR2B受体mRNA表达较空白组、假手术组明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。针刺组、西药组NR1、NR2B受体mRNA表达较模型组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且针刺组NR1、NR2B受体mRNA表达量高于西药组，差异均有统计学意义(P<0.05)。说明AD模型大鼠海马NR1、NR2B受体mRNA表达量下降，而头穴透刺可明显上调NR1、NR2B受体mRNA表达量。详见表3。

表3 各组海马NR1、NR2B受体mRNA表达量比较(±s)

与空白组同时间比较，①P<0.05；与假手术组同时间比较，②P<0.05；与模型组同时间比较，③P<0.05；与西药组比较，④P<0.05。

3 讨 论

NMDA为一种离子型谷氨酸受体，主要分布在神经细胞的突触后膜，在中枢神经系统的发育和神经系统疾病的发生中发挥着重要的作用[5]。NMDA受体是一种异聚体，由亚基NR1、NR2、NR3组成，其中NR1是构成离子通道的基本亚基，NR2是调节亚基，能增强NR1对兴奋性氨基酸的反应[6]。NR2亚基中的NR2B亚型与神经元的记忆与学习能力、可塑性密切相关[7]。学习和记忆的神经生物学基础是突触可塑性，NMDA受体具有参与神经突出可塑性调节的生理功能，特别是对长时增强效应(LTP)具有重要的调节作用[1]。研究发现，降低大鼠海马中NMDA受体磷酸化状况，可使大鼠海马LTP降低和学习记忆功能减低，导致AD的发生[8]。

阿尔茨海默病属于中医学“呆病”“善忘”等范畴，本病病机为髓海不足，神机失司，病位在脑，与心、肾等关系密切。脑为元神之府，与人的记忆能力密切相关，如《类证治裁》言：“脑为元神之府，精髓之海，实记性之所凭也，老人健忘者，脑髓渐空也”。因此，选取头部穴位针刺具有治疗神志疾病的功能，也符合针灸学中选穴的“近治作用”原则。有研究发现，头穴针刺能够改善大鼠学习记忆能力及提高大鼠记忆保持能力[9]。百会、太阳、神庭、上星均为头部腧穴。百会透刺太阳穴区有百会、承灵、曲鬓、太阳等穴，贯穿督脉、足少阳胆经、足太阳膀胱经3条阳经，具有联系多经的特点[10]。有研究表明，百会穴透太阳穴联合盐酸多奈哌齐片能够有效治疗轻度认知障碍[11]。神庭透上星穴为治疗痴呆的头部要穴[12]。神庭、上星均为督脉腧穴，督脉与脑系疾病密切相关，如《难经·二十八难》云：“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑。”神庭是督脉与足阳明胃经、足太阳膀胱经的交会穴，是治疗神志类疾病的要穴，上星穴具有开窍益气充脑的作用[13]。

本实验通过观察AD大鼠的学习记忆能力，发现模型组逃避潜伏期延长、跨越平台次数减少，针刺组、西药组均能够缩短逃避潜伏期、增加跨越平台的次数，说明头穴透刺与盐酸美金刚片均能够明显改善AD大鼠的学习记忆能力。通过对大鼠海马NR1、NR2B受体mRNA表达量比较，发现模型组大鼠海马NR1、NR2B受体mRNA表达量下降，而针刺组、西药组均能够提高AD大鼠海马NR1、NR2B受体mRNA表达量，且针刺组优于西药组。因此，头穴透刺可以改善AD大鼠的学习记忆能力，可能与头穴透刺能够提高海马NR1、NR2B受体mRNA表达量有关。