基于网络药理学探讨参附养心汤治疗心力衰竭的作用机制

郭丽君，马晓昌

1990年—2016 年，随着人口增长和老龄化，缺血性心脏病的年龄标化死亡率仍在增加[1]。心力衰竭是各种心脏疾病的严重表现或晚期阶段，死亡率和再住院率居高不下[2]。容量负荷过重和瘀血症状是大多数急性失代偿性心力衰竭(ADHF)病人住院的主要原因[3]。超滤作为一种替代疗法，被推荐用于顽固性心力衰竭及利尿剂抵抗者[4]。前期研究显示，血液超滤虽然能够替代肾脏的一部分功能，但没有肾气的蒸化功能，不能将体内水液升清降浊，因此，超滤液中不仅包括体内潴留的水液，还包括正常的津液。机体内阴液丢失，就会出现口舌干燥、渴喜饮水、脉细等阴虚证候。津液丢失过多，阴虚而阳气无所依附会出现阴阳两虚的表现[5]。血液超滤虽然能够迅速解决病人的水停之症，但造成了气阴两伤，甚至阳气耗损(统称“正气亏虚”)。益气扶正类中药(参附养心汤)是西苑医院马晓昌主任的经验方，西苑医院是最早开展血液超滤治疗的医院之一，长期的临床实践发现参附养心汤(人参、附子、黄芪、麦冬)联合血液超滤能够减少血液超滤治疗心力衰竭时的不良反应，降低不良事件发生率、再住院率[6-7]。在证实其临床有效性和安全性的基础上，目前对于益气扶正类中药参附养心汤的作用机制尚不明确，因此，本研究拟采用网络药理学的方法，对参附养心汤治疗心力衰竭的作用机制进行初步探讨，为今后的机制研究提供参考及理论基础。

1 资料与方法

1.1 资料 数据库和软件主要包括：中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、GeneCards(https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/)、OMIM(https：//www.omim.org/)、MalaCards(https：//www.malacards.org/)、TTD(https：//db.idrblab.org/ttd/)、Uniprot(https：//www.uni)、STRING(https：//string-db.org)、DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)、VENNY2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、STRING(https：//string-db.org)、DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)、易汉博生物信息在线作图网站(http：//www.ehbio.com/ImageGP/)、Cytoscape3.7.1软件和cytoHubba插件。

1.2 参附养心汤活性成分筛选及靶点预测 通过TCMSP数据库寻找参附养心汤的主要活性成分及潜在靶点，依据药代动力学ADME(吸收、分布、代谢及排泄)，本研究以口服生物利用度(OB)和药物相似性(DL)作为药物成分的筛选条件，以参附养心汤的人参、附子、黄芪、麦冬为关键词，检索TCMSP数据库，对其成分及其作用的靶点进行筛选及构建，筛选条件为OB≥30%，DL≥0.18。查不到的成分应用BATMAN-TCM[8]分析。将成分提交给BATMAN-TCM，以score cut off=20为筛选线，以P<0.05 作为“药物-通路”结构构建的基准，得到活性成分及靶点。

1.3 心力衰竭相关靶点数据构建 本研究以“heart failure”为关键词检索GeneCards、OMIM、MalaCards、TTD数据库综合筛选心力衰竭相关靶点。通过检索以上数据库，去重后获得心力衰竭基因靶点，通过Uniprot数据库查询靶点蛋白的基因名称。

1.4 疾病-药物-成分-靶点网络的构建 将参附养心汤潜在靶点与心力衰竭相关靶点均进行统一标准化命名(Uniprot数据库中的Gene name行标准化命名)，通过Excel表获得参附养心汤-心力衰竭共同靶点。采用Cytoscape 3.7.1软件进行网络构建、可视化分析等。根据Degree筛选出重要药效靶点。

1.5 药物-靶点相互作用网络构建 将参附养心汤-心力衰竭共同靶点导入String蛋白质互作数据库，进行靶点蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，将全节点关系信息导出并利用Cytoscape 3.7.1构建靶点-靶点PPI网络，根据Degree筛选出关键基因(Hub Gene)。

1.6 基因本体论(GO)及KEGG通路富集分析 DAVID数据库是一个包括分析工具和整合生物学相关知识的数据库，可以从海量的基因与蛋白簇中提取有价值的生物学信息，该数据库可以对单个基因进行分析注释从而可以构建GO生物学过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular components，CC)、分子功能(molecular function，MF)及KEGG通路富集结果。

2 结 果

2.1 参附养心汤活性成分筛选及靶点预测 在TCMSP数据库中，根据OB与DL阈值，剔除重复化合物与缺少靶点预测数据的化合物，最终共得出40个活性成分，其中人参17个、附子6个、黄芪17个、麦冬0个，在 BATMAN-TCM 数据库中，检索麦冬的作用靶点，筛选Score cut off≥20、P<0.05的活性成分，获得17个药物活性成分(见表1)。各中药活性成分仍有重叠，删除重复后得到55个活性成分。以S1-S55为序号对化合物成分进行编码。对55个化合物进一步预测，初步获得1 050个靶点，将相同的靶点进行归一，结合Uniprot数据库确认并转换，最终共得到336个靶点。

表1 参附养心汤活性成分筛选

2.2 心力衰竭相关靶点数据构建及比对分析 以“heart failure”为关键词在GeneCards、OMIM、MalaCards、TTD数据库中查询，发现心力衰竭的药物治疗性靶点有GeneCards(1 539)、OMIM(25)、MalaCards(51)、TTD(42)，筛选GeneCards中相关度score>0的基因(527)，结合Uniprot数据库确认并转换、删除重复靶点，最终得到582个。

2.3 疾病-药物-成分-靶点网络的构建 将参附养心汤靶点与心力衰竭靶点导入Excel表进行对比分析，发现心力衰竭与参附养心汤潜在靶点有49个重合，并于VENNY2.1中绘制韦恩图(见图1)。将结果导入Cytoscape软件构建药物-成分-疾病-靶点可视化网络(见图2)。在网络中，节点表示化合物和靶标，连线表示化合物与靶标之间的相互作用。通过根据Degree筛选出排名前10 的重要药效成分(见表2)。

注：蓝色圆形为参附养心汤靶点集合；黄色圆形为心力衰竭靶点集合。图1 参附养心汤与心力衰竭相关靶点韦恩图

注：绿色代表药物成分，蓝色代表参附养心汤-心力衰竭共同靶标。图2 药物-成分-疾病-靶点网络图

表2 参附养心汤治疗心力衰竭的药效成分(前10位)

2.4 靶点-靶点相互作用网络构建 将参附养心汤-心力衰竭共同靶点导入String数据库中。利用Multiple proteins工具，限定物种为人，本研究设定置信度阈值≥0.7，隐藏网络中不相关联的节点，对蛋白相互作用进行筛选，获取蛋白相互作用。结果共涉及49个节点，106条边，平均节度点为4.33，平均局部聚类系数为0.535。线条的颜色代表连接的程度(见图3)。将全节点关系信息导出并导入Cytoscape，利用cytoHubba插件根据Degree筛选出前10种PPI网络核心基因(见图4)，并进行柱状图可视化(见图5)。

图3 参附养心汤作用于心力衰竭潜在靶点之间相互作用网络图

图4 前10种PPI网络核心基因网络图

图5 前10种PPI网络核心基因柱状图

2.5 GO及KEGG通路富集分析 通过DAVID软件对获得的49个参附养心汤-心力衰竭共同靶点进行富集分析，富集分析采用超几何分布设计的算法，针对富集分析显著性P值的多重检验校正使用Benjamini-Hochberg 校正方法。GO 属于基因功能分类体系，有3个分支，即生物过程、分子功能、细胞组分，最终得到211个BP，29个CC，36个MF。生物过程包括：缺氧应答、胰岛素分泌调节、胆固醇代谢过程、血压的负调节、细胞对机械刺激的反应、血管收缩的正向调节、一氧化氮生物合成过程的正调控、衰老、心肌肥大的正调控、血压调节。细胞组成包括：细胞外间隙、线粒体、T型小管、细胞外区域、内质网、高密度脂蛋白颗粒、质膜等。分子功能包括：酶结合、电子载体活性、强直性结合、甾体结合、脂肪酰基-辅酶A结合、NADP结合、胆固醇结合、类固醇激素受体活性、氨基酰化酶活性。应用Excel表根据Enrichment score[-log(PValue )]前10进行柱状图可视化(见图6)。

图6 参附养心汤潜在靶点治疗心力衰竭GO分析柱状图(前10位)

参附养心汤治疗慢性心力衰竭主要富集的KEGG生物学通路有57条，主要包括肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、心肌细胞的肾上腺素能信号通路、醛固酮调节钠重吸收、环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶(PKG)信号通路、甲状腺激素信号通路、钙信号通路、toll样受体信号通路、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信号通路、雷帕霉素受体蛋白(mTOR)信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、细胞凋亡、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、胰岛素分泌等。通过易汉博生物信息在线作图网站(http：//www.ehbio.com/ImageGP/)对KEGG信号富集分析前10结果进行可视化处理(见图7)。其中，X 轴代表富集因子(richfactor，即目标基因中属于这个分支的基因的数量/背景基因集中这个分支所有基因的数量)，Y 轴代表名称，气泡面积大小代表目标基因集中属于这个分支的基因数量，气泡颜色代表富集显著性，即P值的大小。

图7 参附养心汤治疗心力衰竭潜在靶点KEGG分析的气泡图(前10位)

3 讨 论

过去的30年里，慢性心力衰竭病人的预后得到了明显的改善，然而因急性心力衰竭(AHF)住院的病人仍然存在高不良事件风险[9]。对AHF病理生理学的进一步了解为临床医生评估和管理AHF病人提供了一个框架，并强调了旨在改善临床结果的未来治疗目标[10]。容量超负荷是急慢性心力衰竭发生发展的重要病理生理过程。已有的循证医学证据推荐血液超滤用于有明显容量超负荷且常规利尿剂治疗效果不佳的心力衰竭病人[11]。然而，AVOID-HF[12]研究显示，住院心力衰竭病人采用超滤治疗与高剂量利尿剂治疗相比，体质量变化相当，具有减少30 d和90 d心力衰竭再住院或心血管事件的趋势，但未降低90 d死亡率，且局部不良并发症更多。前期的研究也显示，血液超滤治疗后的病人普遍存在气阴两伤，甚至阳气耗损(统称“正气亏虚”)的表现，而血液超滤结合益气扶正类中药(参附养心汤)可以改善病人的症状，改善呼吸困难指数[7]。

参附养心汤由人参、附子、黄芪、麦冬组成。根据Degree值筛选出参附养心汤治疗心力衰竭的主要有效成分存在于人参、黄芪、麦冬之中居多。方中人参具有大补元气、补益肺脾、生津止渴、宁神益智的功效。黄芪乃补气圣药，能补一身之气，兼有升阳，固表止汗，利水消肿的作用。二者配伍，生晒参补而能守，生黄芪补而能行，二者使补而不滞。麦冬滋阴养心，故本方益气养阴效果更佳，从侧面验证了该方可以明显改善超滤后病人的气虚、阴虚症状。研究显示参附养心汤的多个化合物可作用于同一个靶点，一个化合物也可以调控多个靶点，证实了中药多成分、多靶点的特点。

网络药理学基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络系统综合观察药物对疾病网络的干预与影响，将网络药理学与中医药学结合研究，在中药已知化学成分，疾病已知靶点的基础上，充分利用已有的研究成果，将研究方式从“单靶点-单药物”模式更新为“网络靶点-多组分”模式，揭示“药物-基因-疾病”共模关联。通过网络药理学预测，参附养心汤治疗心力衰竭可能的主要作用靶点是白细胞白介素-6(IL-6)。有研究显示IL-6水平随充血性心力衰竭的严重程度而增加，血浆中IL-6的增加主要与交感神经系统的激活有关。高水平的IL-6独立于左心室射血分数和血浆去甲肾上腺素，预测充血性心力衰竭病人的预后[13]。中和促炎细胞因子和抑制细胞内信号通路和随后的基因表达是近期最有希望的治疗策略之一[14]。实验数据和人类研究已经证明了细胞因子的Janus性质，要么是细胞保护作用，要么是有害的。它强调了细胞因子作用的动态方面，需要解决诸如浓度、产生时间和它们激活的受体类型等问题。靶向控制激活心力衰竭的安全通路无疑是一个有效的治疗目标，但在考虑这一点之前，必须仔细描述慢性和急性心力衰竭中促炎细胞因子的精确动力学和生物活性特征[15]。许多中药具有双向调节作用，该方是否能够双向调节细胞因子，使其达到动态平衡需要进一步研究。

KEGG通路主要富集到TNF信号转导途径，TNF信号通路与MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡密切相关。然而，目前关于调节TNF治疗心力衰竭的药物临床研究结果并不理想，如可溶性肿瘤坏死因子受体依那西普[16]和肿瘤坏死因子α(TNF-α)单克隆抗体英夫利昔单抗[17]。然而，白细胞介素-1β(IL-1β)靶向卡纳金单抗确实能够减少冠心病病人的炎症标志物和心血管事件[18]。参附养心汤调控心力衰竭的重要靶点有IL-6、MAPK、IL-1β，在今后的科研中可以研究这些靶点是否参与了参附养心汤对于心力衰竭的调控。有研究显示TNF-α抑制β-肾上腺素能受体，导致交感神经激素的反馈增加，进而导致促炎症细胞因子TNF-α的前向升高，从而导致自我延续周期，而这种循环独立于由损伤引起的促炎和抗炎反应，导致有害的信号机制，引发心肌肥大、有害重构和心力衰竭[19]。表明疾病的各种机制间相互作用，相互影响，对于疾病的治疗不能着眼于单靶点、单通路，而应该向多靶点、多途径靠拢。本研究显示参附养心汤不仅可以作用于TNF信号通路，还可以作用于心肌细胞的肾上腺素能信号。

综上所述，参附养心汤治疗心力衰竭具有“多成分、多靶点、多途径”的作用特点，可为今后验证该药具体作用靶点和信号通路提供依据，减少资源的浪费，也有助于该药的二次开发。其主要生物学机制可能与以TNF为中心的信号通路有关。本研究尚存在一些局限，如有效成分相关靶点寻找和确认方法需要进一步优化，在今后的研究中需要检测参附养心汤的入血成分，进而进行网络药理学研究，使结果的可信程度更高。通过网络药理学探讨参附养心汤治疗心力衰竭作用靶点尚属预测，需要开展动物实验研究这些靶点是否参与了参附养心汤对于心力衰竭的调控，对这些因子是上调还是下调，以及是否通过以TNF为中心的通路发挥作用。