瓦氏黄颡鱼病原菌的分离鉴定及防控药物筛选

贾 丹，孔令富，严 晖，戴春祥，胡 青，高 宇

(云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

【研究意义】黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)和瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)均隶属于鲇形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黄颡鱼属(Pelteobagrus)[1]，具有味道鲜美、口感好、无肌间刺且营养价值高等特点，深受消费者的青睐。该鱼市场需求量大，价格高，是中国主要的水产养殖品种[2～3]。瓦氏黄颡鱼是近几年兴起的一种本土经济鱼类，随着人工养殖规模的不断扩大，集约化的发展，有的爆发性疾病日趋严重[4]。由于自然环境、养殖密度、饵料和水质等因素的影响，黄颡鱼在养殖过程中发生的病害日趋增多。【前人研究进展】黄颡鱼疾病出现的赤皮、水肿、体表溃疡、腹水等症状均为感染嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)所引起[4-7]。嗜水气单胞菌(A.hydrophila)属于弧菌科、气单胞菌属，是嗜温、有动力的气单胞菌群，可从淡水、污水中分离得到[8]，是一种典型的人、兽、鱼共患病病原菌[9]。目前，由嗜水气单胞菌引起的疾病大多采用抗生素进行防治，但抗生素不科学的施用已产生严重的耐药性[10]，且耐药性随着菌株传代次数的增加而增强[11]；加之嗜水气单胞菌常与其他致病菌的混合感染，增加了对嗜水气单胞菌的防治难度。在水产养殖过程中，随着对细菌性疾病防治安全性和生态性要求的不断提高，嗜水气单胞菌已引起国内外学者的高度重视。【本研究切入点】2017年8月云南省某养殖有限公司的瓦氏黄颡鱼死亡的发生，给该地的养殖户造成了很大的经济损失。【拟解决的关键问题】为此，针对云南省养殖的患病瓦氏黄颡鱼问题，对分离菌进行了形态观察、生理生化鉴定、16S rRNA和主要粘附素基因(major adhesin gene，Mah)序列分析，从患病鱼体肝脏中分离鉴定出嗜水气单胞菌，并对分离菌株进行了药敏试验，旨在为有效控制由嗜水气单胞菌引起的相关疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 患病鱼解剖与观察

患病瓦氏黄颡鱼，2017年8月由云南省安宁市八街镇安宁友谊观赏鱼养殖有限公司提供。对发病瓦氏黄颡鱼进行解剖，以肉眼观察和镜检相结合的方法，对发病鱼体表、鳃和内脏的病症及有无寄生虫进行观察并记录其症状。送检的瓦氏黄颡鱼大部分出现体表溃疡(图1)，挑取溃疡部位压片镜检，无真菌菌丝；肛门红肿。解剖后，可见肠道内无食物残留，腹腔内有少量淡黄色粘稠积液，肝脏呈淡红色，胆囊肿大。

图1 患病瓦氏黄颡鱼的典型临床症状

1.2 病原菌的分离纯化

用75 %的酒精棉球对具有典型症状的濒死瓦氏黄颡鱼体表进行消毒，无菌条件下从鱼体表溃疡处、肝脏、脾脏和肾脏等部位穿刺取样，接种于BHI(OXOID公司)琼脂平板上，28 ℃恒温培养24 h，长出单菌落后，平板划线法对细菌进行纯化。将单一形态菌落接种于BHI液体培养基中，28 ℃振荡培养24 h，取1 mL菌液加入20 %无菌甘油保存于-20 ℃中备用。

1.3 分离菌的生理生化鉴定

取纯化后的菌落分别接种在BHI平板和血琼脂(Solarbio公司)平板上，28 ℃培养24 h后观察菌落特征及溶血性，革兰氏染色观察菌体形态。无菌条件下，将纯化菌株接种于细菌生理生化微量鉴定管(杭州微生物试剂有限公司)中，对其碳水化合物、氨基酸、明胶和吲哚等进行生理生化指标分析。

1.4 16S rRNA和Mah基因扩增及系统发育树分析

将保存菌株接种在BHI平板中培养24 h，挑取单菌落接种于BHI液体培养基中，150 r/min 28 ℃振荡过夜后，用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取菌株基因组DNA。PCR反应体系为50 μl：包含1 μl DNA模板，25 μl Master Mix(昆明硕擎生物有限公司)，特异性引物各1 μl(表1)，加ddH2O至50 μl。PCR反应循环为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR反应结束后，取5 μl扩增的产物使用6×核酸上样缓冲液点样，GelRed试剂(Biotium公司)按1∶10 000溶于1 %琼脂糖凝胶溶液中，采用1×TAE电泳缓冲液以5 V/cm电泳30 min后，用紫外透射仪(JY02型)观察电泳条带，并将PCR产物送昆明硕擎生物有限公司测序。

将测定菌株的16S rRNA和Mah基因序列在GenBank中进行Blast搜索和分析，选用Clustal W法与已知的嗜水气单胞菌16S rRNA和Mah序列进行同源序列比对并推导Mah的氨基酸序列。以16S rRNA核苷酸和Mah氨基酸序列为分子标记，分别用DNAstar软件包中的MegAlign计算序列相似性；用MEGA7软件中邻接法(NJ)构建16S rRNA核苷酸和Mah氨基酸系统发育树，自展法(Bootstrap)进行1000次重复，并用一致性指数(consistency index，CI)来衡量分析结果的可靠性。

表1 特异性引物序列

1.5 分离菌的人工回归感染试验

供试鱼在循环水养殖缸中暂养7 d后，将保存的菌株接种于BHI液体培养基中，28 ℃ 150 r/min振荡培养24 h，4000 r/min离心5 min收集菌体，0.6 %生理盐水重悬。利用分光光度计准确调整菌液浓度为1.0×107cfu/mL，对供试鱼进行胸鳍基部注射，实验组0.2 mL/尾，对照组注射0.2 mL/尾0.6 %生理盐水。观察并记录7 d内供试鱼死亡数及症状，发病时水温，剖检死亡或濒死供试鱼，并从其肝脏、肾脏等部位再次分离细菌，进行菌体形态观察和生理生化鉴定。

1.6 药敏试验

氨苄青霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考、硫酸新霉素、诺氟沙星、盐酸环丙沙星药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；新诺明、磺胺嘧啶、甲砜霉素购自BCMEI公司，磺胺二甲嘧啶、噁喹酸购自华夏试剂有限公司，根据《淡水养殖鱼类疾病与防治手册》[12]由实验室制作其余药敏片。

采用纸片琼脂扩散法(K-B法)进行药敏试验，将分离纯化菌株接种于BHI液体培养基中，28 ℃培养24 h后，0.6 %生理盐水调整菌浓度为1.0×107cfu/mL，取150 μl菌液均匀涂布于BHI琼脂平板上，同时粘贴药敏纸片，每皿4片，每种药3个重复，经28 ℃培养24 h后观察并测量记录药敏片周围抑菌圈的直径，以抑菌圈直径大小作为指标对实验结果进行判定。

2 结果与分析

2.1 菌株形态观察

将从肝脏中分离的菌株命名为Ah0003，接种在血琼脂平板上，28 ℃培养24 h后，菌株呈圆形、中央隆起、表面光滑、边缘整齐、半透明、灰白色，有溶血环出现。该菌在BHI平板上生长良好；分离纯化后的细菌经革兰氏染色后为阴性，普通光学显微镜400×下可见菌体两断钝圆、短杆状。

2.2 生理生化特性检测

常规生理生化特性测定结果表明，该菌株能利用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖等，不能利用山梨糖、棉子糖、纤维二糖、鼠李糖、乳糖和密二糖等，与乙酰胺、肌醇反应为阴性，赖氨酸、精氨酸水解酶实验为阳性，吲哚实验、运动性实验和明胶实验为阳性(表2)，根据以上特征，初步鉴定为嗜水气单胞菌。

表2 Ah0003菌株的主要生理生化特征

注：+：阳性；-：阴性；NA：未提供。

Note: +: Positive;-: Negative; NA: not applicate.

图2 11株气单胞菌属菌株16s rRNA序列系统发育树

2.3 Ah0003菌株的16S rRNA基因序列分析

通过对Ah0003菌株的基因组DNA进行PCR反应，得到一段长度序列为1500 bp左右的PCR扩增产物。测序结果显示Ah0003 16S rRNA序列长为1374 bp。

将Ah0003菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank进行BLAST搜索，与已经报道的嗜水气单胞菌16S rRNA基因序列进行分析，并构建系统发育树(图2)。菌株Ah0003与A.hydrophila自然构成一个分支(bootstrap 93)。将Ah0003核苷酸序列用DNAstar软件进行序列同源性分析，结果显示Ah0003与A.hydrophila16S rRNA的序列相似性为99.5 %。

图4 几株嗜水气单胞菌Mah氨基酸序列系统发育树

2.4 Ah0003菌株的主要粘附素基因(Mah)序列分析

克隆得到致病菌株Mah部分序列见图3，推导的蛋白质编码318个氨基酸残基，分子量为34.694 kDa，与嗜水气单胞菌菌株WC10-1、NSAH-01、BA17、GA1和TPS-30氨基酸相似性分别为99.7 %、99.7 %、84.1 %、83.9 %和87.5 %。Ah0003与WC10-1的Mah氨基酸序列高度同源，聚类为嗜水气单胞菌主要粘附素基因的一个分支(图4)。

2.5 回归感染实验

Ah0003菌株对瓦氏黄颡鱼和尼罗罗非鱼均有比较强的致病力(表3)，供毒后第2天开始出现死亡现象，水温均为25 ℃，供毒7 d内累计死亡率分别为90 %和100 %，发生死亡的瓦氏黄颡鱼症状与自然病例相同，对照组在观察期14 d内无明显疾病症状，无鱼体死亡。从人工感染濒死的鱼体肝脏和肾脏中，均再次分离到与自然发病分离菌相同的细菌。

图3 Ah0003菌株Mah核苷酸与推测的氨基酸序列

表3 人工感染试验结果

表4 Ah0003菌株对药物敏感性的实验结果

注：S：高度敏感；I：中度敏感；R：不敏感。

Note: S: Highly sensitive; I: Moderately sensitive; R: Insensitive.

2.6 分离菌株的药物敏感性

如表4所示，供试菌株对盐酸环丙沙星、诺氟沙星、噁喹酸3种药物高度敏感；对盐酸多西环素、氟苯尼考、硫酸新霉素、磺胺二甲嘧啶4种药物敏感；对氨苄青霉素、磺胺嘧啶、新诺明、甲砜霉素4种药物不敏感。

3 讨 论

近年来，随着水产养殖品种的多元化，养殖规模的不断扩大，加之品质、种质以及不良环境等因素的影响，水产病害日趋严重，导致养殖户亏损风险不断增大。针对瓦氏黄颡鱼的养殖现状，以及养殖场的常见疾病，研究对鱼病的预防、控制、治疗的有效措施势在必行。

嗜水气单胞菌是引起水产动物细菌性败血症的重要病原菌之一，多数菌株为条件性致病菌，可引起鱼和虾感染发病。如嗜水气单胞菌感染草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、青鱼(Mylopharyngodonpiceus)和异育银鲫(Carassiusauratus)引发细菌性败血症[14-16]；导致克氏原螯虾(Procambarusclarkii)和凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)爆发性死亡[17-18]。2012-2017年，广西多地发生嗜水气单胞菌感染黄颡鱼致死的病例报道，经济损失严重，症状大多为体表溃疡、大量腹水、肠炎和肝脏发白等[6-7,19]。从体表溃疡的瓦氏黄颡鱼体内分离得到的嗜水气单胞菌对尼罗罗非鱼同样具有致病性，提示嗜水气单胞菌在不同水产养殖物种中可能存在跨物种传播。

细菌核糖体RNA(rRNA)包括5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA 3种类型。5S rRNA基因序列较短，不适合鉴定细菌种类；23S rRNA基因序列较长，且其碱基突变率高，不适合鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16S rRNA基因序列适中且具有保守性、普遍性和稳定性等特点，可对微生物进行简便、快速、准确的分类鉴定[20]。常规的微生物生理生化鉴定需要测定多项理化指标，操作繁琐，由于弧菌科种类繁多，种间的生理生化反应差异小，很难鉴定出其属于哪一种细菌，分子生物学方法对传统细菌鉴定起到了很好的补充作用[21]。Mah为嗜水气单胞菌的毒力因子之一，主要作用是通过粘附素定植于宿主组织细胞表面，研究表明Mah融合表达的蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，能显著减少不同Ah菌株对鲤鱼上皮瘤细胞的粘附作用[22]。

2012-2017年从广西多地患病黄颡鱼中分离出嗜水气单胞菌，该嗜水气单胞菌株对硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸环丙沙星、磺胺二甲嘧啶、氟奎诺酮类等药物敏感，对青霉素、氨苄青霉素、复方新诺明等药物不敏感[7,19]。2015年江苏地区暴发黄颡鱼出血性肠炎，分离到的2株嗜水气单胞菌显示出不同的耐药性，但均对依诺沙星、头孢曲松、恩诺沙星等药物敏感，对青霉素和链霉素等药物产生耐药性[5]。2011年从浙江地区患病的西伯利亚鲟体内分离得到1株嗜水气单胞菌，对庆大霉素、强力霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、阿奇霉素及左氧氟沙星等药物高度敏感，但对青霉素、红霉素和阿莫西林等药物具有耐药性[23]。供测试的11种抗生素中，云南省分离的嗜水气单胞菌同样对氨苄青霉素等药物出现耐药，提示嗜水气单胞菌对氨苄青霉素的耐药性已广泛存在。但该致病菌对盐酸环丙沙星、磺胺二甲嘧啶和氟苯尼考等药物的敏感程度与广西等地分离的嗜水气单胞菌实验结果存在差异，究其原因与不同养殖区域的养殖环境、养殖技术以及用药习惯等有关，或是细菌的高突变率导致其快速进化，从而引起菌种之间耐药性的差异。

4 结 论

通过形态学、生理生化特征、16S rRNA和Mah基因序列将从云南省患病瓦氏黄颡鱼肝脏中分离的Ah0003菌株鉴定为嗜水气单胞菌；Ah0003对盐酸环丙沙星、诺氟沙星、噁喹酸高度敏感，可考虑作为防治瓦氏黄颡鱼嗜水气单胞菌引起相关疾病的药物。