HPLC测定氯虫苯甲酰胺在烟草和土壤中的残留与消解动态

黄 丽，邓毅书，浦恩堂，代雪芳，李文希，王 静，刘朝敏，张雪燕

(1.云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明 650201；2.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205，3. 昭阳区植保植检站，云南 昭阳区 657000)

【研究意义】农用化学品的大量使用导致农业生态环境不断恶化，人民对环境和农产品安全的关注不断增加。农药残留是否合格是烟草安全的重要指标，也是影响烟草行业竞争力的重要因素。开展农药田间施药试验，研究农药在烟草和土壤中的残留动态对保护环境和安全用药、保障烟草品质具有重要意义。【前人研究进展】氯虫苯甲酰胺是美国杜邦公司从邻氨基苯甲类化合物里开发的具有新型结构的(双酰胺/吡唑类)S高效广谱杀虫剂, 其主要作用机理是通过激活昆虫的兰尼碱受体，释放平滑肌和横纹肌细胞内贮存的钙离子，引起肌肉调节衰弱、麻痹，使害虫死亡[1]。氯虫苯甲酰胺对鳞翅目、鞘翅目叶甲科、双翅目潜蝇科、烟粉虱等多种害虫防治效果显著，广泛应用于烟草、水稻和果蔬的害虫防治[2-3]。氯虫苯甲酰胺的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[4-7]、液相色谱-质谱法或串联质谱法(LC-MS或UPLC-MS/MS)[8-14]等，主要涉及的作物有水稻、大豆、铁皮石斛、蔬菜等。其中，杨玉霞[15]对氯虫苯甲酰胺在果蔗及其土壤中残留分析方法进行了探讨；秦冬梅[16]对土壤和番茄中氯虫苯甲酰胺的残留检测与消解动态进行了研究。目前，国内尚未见氯虫苯甲酰胺在烟草中的残留分析方法和消解动态研究的公开报道。【本研究切入点】基于液相色谱-质谱法检测成本高昂的限制，开发常规的分析检测方法是一个很好的选择，但是，如何解决烟草这种复杂基质的样品净化是问题的关键。【拟解决的关键问题】采用乙腈提取、正己烷液-液分配、硅胶柱和氨基柱固相萃取净化解决烟草基质复杂样品难净化的问题，建立高效液相色谱法测定烟草和土壤中氯虫苯甲酰胺残留量的分析方法。该方法灵敏度、准确度和精确度都符合农药残留标准的要求，方法具有一定的新颖性。在此方法的基础上，对氯虫苯甲酰胺在烟草和土壤中的消解规律及最终残留进行系统研究，为氯虫苯甲酰胺的合理使用及其安全性评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点、药剂及作物

田间试验于2017年分别在云南宣威、山东青岛两地进行，试验农药为5 %氯虫苯甲酰胺悬浮剂，试验的烟草品种为当地推广品种。

1.2 田间实验设计

1.2.1 实验概况 按农药残留试验准则(NY/T 788-2004)[17]的要求进行试验设计，小区面积30 m2，重复3次，设空白对照，使用推荐剂量为残留试验的低剂量，1.5倍推荐剂量为残留试验的高剂量，残留试验高剂量的3倍作为烟草植株消解动态试验的施药剂量，残留试验高剂量的5倍作为土壤消解动态试验的施药剂量。

1.2.2 残留消解动态试验 采用一次施药多次采样方法，烟草植株：喷雾施药，按 185.63 g a.i./hm2施药。土壤：烟草植株实验进行的同时，在距烟草植株试验地3 m质地相同的空地，喷施按309.38 g a.i./hm2施药，施药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、30 d、45 d随机采样。

1.2.3 最终残留试验 设41.25和61.875 g a.i./hm22个施药剂量。每个剂量分别施药1和2次，施药间隔期为7 d，于末次施药5、7、14 d后随机采样。

1.3 实验室样品制备

最终残留烟草样本需制成成品干烟叶。将田间采集的烟草鲜叶样本按不同处理分别编竿并挂贴标签，按照当地生产商品烟叶烘烤规程在烤房中烘烤，烘烤后的成品烟叶趁干用样品磨磨碎，过40目筛混合均匀。

1.4 分析和检测方法

1.4.1 仪器与试剂 仪器：Agilent-1200液相色谱仪(美国安捷伦公司)、离心机(上海安亭科学公司)、小型旋涡混匀仪(北京踏锦公司)、旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)。

试剂：氯虫苯甲酰胺标准品纯度99.9 %，Dr公司提供；乙腈、甲苯、甲醇、丙酮均为色谱纯，磷酸为优级纯，氯化钠为分析纯、屈臣氏蒸馏水；硅胶(粒度0.18～0.22 mm)，130 ℃烘烤 5 h，干燥器中保存，使用时加1.5 %的水失活；氨基小柱规格为1000 mg/6mL。

1.4.2 提取 干烟叶：称取样品3.0 g于50 mL带盖离心管中，准确加入乙腈30 mL，涡旋提取20 min，以3000 r/min转速离心5 min。取上层清液10 mL于50 mL带盖离心管中，加10 mL的饱和NaCl溶液、20 mL正己烷，剧烈振荡1 min，离心。舍去上层正己烷，中层乙腈转移至150 mL的浓缩瓶中，再加10 mL乙腈至50 mL的离心管中萃取1次，合并乙腈层，45 ℃水浴旋蒸吹干，加2～3 mL丙酮∶正己烷(1∶9，v/v)混合液溶解残留物，先过硅胶柱净化，再过氨基小柱净化。

烟草植株(鲜)和土壤：称取植株样品3.0 g(土壤5.0 g)于50 mL带盖离心管中，先加2 mL水，再准确加入30 mL(土壤25 mL)乙腈，涡旋提取20 min，加NaCl 2 g剧烈振荡1 min，以3000 r/min转速离心5 min，取上层清液10 mL于150 mL浓缩瓶中，45 ℃水浴旋蒸吹干，加2～3 mL乙腈∶甲苯(1∶9，v/v)混合液溶解残留物，待氨基小柱净化。

1.4.3 净化 硅胶柱净化：1 g自制硅胶小柱，丙酮湿法装柱，用5 mL丙酮∶正己烷(1∶9，v/v)预淋，将上述干烟叶样品提取液转入柱中，用10 mL丙酮:正己烷(1∶9，v/v)混合液分三次清洗浓缩瓶，依次倒入柱中，继续用此液10 mL淋洗，流出液弃去，改用20mL丙酮∶正己烷(2∶8，v/v)混合液淋洗，收集此部分洗脱液于150 mL浓缩瓶中，于45 ℃水浴旋蒸吹干，加2～3 mL乙腈∶甲苯(1∶9，v/v)混合液溶解残留物，待氨基小柱净化。

氨基柱净化：氨基小柱依次用10 mL甲醇、5 mL乙腈∶甲苯(1∶9，v/v)预淋，将上述样品提取净化液转入柱中，用10 mL乙腈∶甲苯(1∶9，v/v)混合液分3次清洗浓缩瓶，依次倒入柱中，流出液弃去，改用20 mL乙腈∶甲苯(35∶65，v/v)混合液淋洗，收集此部分洗脱液150 mL浓缩瓶中，45 ℃水浴旋蒸吹干，甲醇定容1 mL，过0.45 μm滤膜，待液相色谱测定。

1.4.4 液相色谱检测条件 检测仪器：Agilent 1200液相色谱仪 配DAD检测器，色谱柱：CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相∶甲醇/0.05 %磷酸溶液(60∶40，v/v)，流速1 mL/min；柱温：30 ℃；吸收波长：254 nm，进样量：10 μl。

1.4.5 标准曲线 准确称取氯虫苯甲酰胺标准品0.0100 g，甲醇溶解定容至10 mL，浓度为1000 μg/mL的标准储备液，然后用甲醇逐级稀释成浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的系列标准液，按1.4.4仪器条件测定，以标准溶液的质量浓度(x)对峰面积(y)绘制标准曲线，对未知样品进行定量计算。

1.4.6 添加回收率实验 在未施药的空白烟草和土壤样本中分别添加氯虫苯甲酰胺标准溶液，干烟叶和植株添加浓度均为0.1、1和10 mg/kg，土壤为0.05、0.5和5 mg/kg，每个水平重复5次，按所建立的方法提取、净化和检测，计算添加回收率和相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 净化方法的确定

干烟叶中含有大量的油脂、色素、烟碱及其它较为复杂的脂溶性物质，样品前处理难度较蔬菜和水果大得多，处理步骤也复杂得多。选用乙腈为提取溶剂，利用乙腈、正己烷和水互不相溶的特性以及氯虫苯甲酰胺在3种溶剂中溶解度的差异进行液-液分配萃取。氯虫苯甲酰胺几乎不溶于正己烷(溶解度<0.0001 g/L)，微溶于水(溶解度0.001 g/L)，在乙腈中的溶解度为0.711 g/L[2]。在液-液分配时，正己烷带走了大部分脂溶性杂质，一部分水溶性杂质留在了水中，氯虫苯甲酰胺通过2次萃取被保留在乙腈中，再通过随后的硅胶柱和氨基柱固相萃取，让氯虫苯甲酰胺和剩余的杂质进一步分离，取得了较为满意的净化效果，详见图1～4。

2.2 氯虫苯甲酰胺标准曲线的线性范围

采用峰面积外标法定量。在0.05～10 μg/mL范围内，农药的质量浓度与峰面积有良好的线性关系，测定结果见表1,其线性回归方程：y=16.456x+0.69，相关系数r2=0.9997，详见图5。

图1 氯虫苯甲酰胺标准品色谱

图2 干烟叶空白对照色谱

图3 干烟叶添加(10 mg/kg)色谱

图4 干烟叶实测色谱

图5 氯虫苯甲酰胺标准曲线

2.3 氯虫苯甲酰胺的回收率和定量限

烟草和土壤中氯虫苯甲酰胺的回收率见表1。干烟叶和烟草植株在0.1、1、10 mg/kg的添加浓度下，其回收率分别为85.7 %～92.8 %和84.5 %～90.3 %，相对标准偏差分别为2.6 %～7 %和3.7 %～7.6 %；土壤在0.05、0.5、5 mg/kg的添加浓度下，其回收率为80.8 %～92.4 %，相对标准偏差为3.4 %～6.9 %，准确度和精密度均符合农药残留分析的要求。氯虫苯甲酰胺在干烟叶和植株中的定量限为0.1 mg/kg，在土壤中的定量限为0.05 mg/kg。

2.4 残留消解动态试验

一年两地烟草植株消解动态试验结果见表2。氯虫苯甲酰胺在烟草植株和土壤中的残留量均随时间的延长而逐渐降低，其消解过程符合动力学一级降解模型。云南烟草植株中氯虫苯甲酰胺的消解方程为C=3.5199e-0.058t，相关系数R=0.9649，半衰期为12 d；山东烟草植株的消解方程为C=8.5151e-0.052t，相关系数R=0.9807，半衰期为13.3 d。

氯虫苯甲酰胺在土壤中的消解比烟草植株慢得多，云南和山东到45 d时消解率分别达77 %和66 %，半衰期分别为24.8和27.7 d，但仍然属于易降解农药(T1/2<30 d)[1]。

2.5 最终残留量

5 %氯虫苯甲酰胺悬浮剂以其推荐剂量41.25 g a.i/hm2和1.5倍推荐剂量61.875 g a.i/m2分别喷雾处理1和2次，施药间隔为7 d。末次施药后5、7、14 d采集烟叶和土壤样品进行分析检测，由表4可知：氯虫苯甲酰胺在干烟叶和土壤中的最终残留量随着施药次数的增加而升高，随着施药浓度的增大而升高，随着采收期的延长而降低。山东青岛末次施药后14 d，干烟叶中氯虫苯甲酰胺的最高残留量为7.7 mg/kg,土壤中的最高残留量0.087 mg/kg；云南宣威末次施药后14 d，干烟叶中的最高残留量为7.1 mg/kg，土壤中的最高残留为0.19 mg/kg。

3 讨 论

采用乙腈对本底基质较为复杂的烟草样品进行涡旋振荡提取，利用正己烷、乙腈和水互不相容的特性对氯虫苯甲酰胺进行液-液分配萃取，首先除去大部分脂溶性和水溶性杂质，再通过固相萃取将极性较大的杂质保留在硅胶柱上，洗脱下来的氯虫苯甲酰胺和剩余的部分杂质通过氨基小柱净化进一步分离，从而满足液相色谱DAD检测的需要。该方法净化过程中采用的液-液分配萃取全部是在50 mL的离心管中进行，相对于传统的分液漏斗液-液分配，大大减少了有机溶剂的用量，减少了资源浪费和环境污染。该方法用高效液相色谱二级管阵列检测器检测，相对于质谱检测器，样品检测结果稳定，重复性较好，更重要的是液相色谱DAD检测成本相对廉价，易在更多的实验室里实现，因此，该检测方法具有更好的推广基础。

表1 氯虫苯甲酰胺在干烟叶、烟草植株(鲜)和土壤中的添加回收率(n=5)

表2 氯虫苯甲酰胺在烟草植株和土壤中的消解动态试验结果

表3 氯虫苯甲酰胺在烟草和土壤中的最终残留量

注：ND 表示农药残留量低于方法的定量限0.05 mg/kg。

Note ：ND indicates that pesticide residues are lower than the quantitative limit of 0.05 mg/kg.

通过2017年云南、山东两地残留试验结果，两地烟草和土壤中氯虫苯甲酰胺的残留动态基本一致，表现为随着施药剂量的增高和施药次数的增多，其在烟草和土壤中的残留量也相对增高。施药后随着时间的推移，氯虫苯甲酰胺在环境中逐渐降解。根据化学农药环境安全评价试验准则[18]，氯虫苯甲酰胺在土壤中降解的半衰期范围为24.8和27.7 d，小于30 d，属于易降解农药。

目前尚未见到中国规定的氯虫苯甲酰胺在烟草上的最大残留限量(MRL)标准，国际烟草科学研究合作中心在2013年7月发布的CORESTA GUIDE No1 农药残留限量指南[19]中规定氯虫苯甲酰胺在烟草中的最大残留限量(GRLs)标准为10 mg/kg。根据2017年在云南、山东规范GAP残留试验结果，5 %氯虫苯甲酰胺悬浮剂以有效成分含量41.25和61.875 g a.i./hm2在烟青虫发生期分别喷雾施药1和2次，末次施药后5、7、14 d分别采集烟叶样品分析检测，干烟叶中氯虫苯甲酰胺的平均残留量分别为3.4～12、1.3～11和2.1～7.7 mg/kg。据此推断，该施药模式下14 d后采集的烟叶烘烤制成的成品烟是安全的。

4 结 论

(1)建立了液相色谱法检测氯虫苯甲酰胺残留量的分析方法，该方法操作相对简便，精密度、准确度和灵敏度均符合农药残留标准的要求，适用于烟草和土壤中氯虫苯甲酰胺残留测定。

(2)氯虫苯甲酰胺在烟草植株和土壤中的消解动态均符合一级动力学方程，消解速度先快后平缓，消解率随着时间延长而增加，在烟草植株和土壤中的半衰期分别为12～13.3和24.8～27.7 d，属易降解农药。

(3)在使用5 %氯虫苯甲酰胺悬浮剂防治烟草虫害时，建议按推荐剂量41.25 g a.i./hm2，最多施药2次，安全采收间隔期为14 d。