基于网络药理学探究桃仁—红花药对治疗膝骨关节炎的机制

雷升，芮轶群，王娟，窦志芳，任锡禄

（1.山西中医药大学，山西 太原；2.山西中医药大学附属医院，山西 太原）

0 引言

骨性关节炎（Osteoarthritis OA）是一种以关节软骨变性和丢失及关节边缘和软骨下骨骨质再生为特征的慢性关节炎疾病[1]，是导致人们发生疼痛、致残以及增加社会经济成本的主要疾病之一[2]。据预测，2050年我国老年人口将达到4.8亿，几乎占全球老年人口的25%，是世界上老年人口最多的国家[3]，而世界范围内60岁以上的人群中有10%的男性以及18%的女性受到该病严重的影响[4]。

目前临床上对于膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis KOA）的治疗多运用糖皮质激素、非甾体抗炎药联合玻璃酸钠的疗法进行治疗[2]，但这些疗法大多会产生继发性关节损害、肾毒性、胃肠道不适等不良反应[5-6]。中医药治疗本病有显著疗效[7-10],有研究报道，古今众多医家、研究认为瘀血与KOA的病因有密切的联系[11]；活血化瘀法在临床上亦多用作本病的关键疗法[12—13]。

有研究发现，用于活血化瘀的经典药对桃仁—红花药对（THYD）在临床上治疗KOA的运用频次较高[14—15]。秦氏[16]在实验中发现以桃仁、红花为君药的桃仁膝康丸可以通过诱导软骨细胞自噬延缓或阻止外科手术诱导的大鼠膝关节OA 的软骨退变。因此本研究拟运用网络药理学研究方法探讨THYD治疗KOA的机制。

1 资料与方法

1.1 选取桃红药对活性成分

在TCMSP数据库[17](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)上分别搜索桃仁以及红花的潜在药效成分。口服生物利用度和类药性指数是网络药理学用于筛选有效成分的常用指标，口服生物利用度(oralbioavailability, OB)是指制剂中药物被吸收进入人体循环的速度与程度，类药性指数(drug like index, DL)是指化合物与已知药物的相似性。中药的活性成分必须具有较高的成为药物的可能性，并且能被人体利用。有研究认为，OB>30%符合人体对药物的利用程度，DL>0.18意味着该成分具有成药性的可能[18-19]。因此本研究选用上述两个指标对该药对药效成分进行筛选后选取合适的成分。

1.2 检索KOA 的相关靶点

通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/search）、OMIM（https://www.omim.org/）等 网站以“Knee Osteoarthritis”为关键词进行检索，收集所检索的疾病相关靶点。

1.3 筛选药物—疾病的共同靶标基因

运用R语言软件（Rx64 3.6.0）对“1.1”的结果和“1.3”结果进行比对与绘制Venn图。筛选出THYD与KOA的共同靶标基因，并用R语言软件下载Venn图绘图软件使之可视化。

1.4 构建活性成分—靶点—疾病网络

采用 Cytoscape 3.7.1 软件构建“药效成分—靶点—疾病”网络，设置网络节点、边等属性。其中，节点代表成分及作用靶点，边代表成分与靶点相互作用关系。根据节点和边数计算成分、靶点相应节点平均度（成分与靶点关联的平均程度），将THYD的药效成分与KOA作用靶标导入Cytoscape 3.7.1软件，构建其药效成分-靶点—KOA网络。

1.5 构建与分析蛋白互作网络（PPI）

把“1.3”中的共同靶标基因用 STRING数据库（https：//stringdb.org/）进行检索，设定物种为“Human”（人类），在设置中设定 “High confidence”为0.7，其余设定不变，获取THYD治疗KOA潜在靶标的相互作用关系图后导出，并且把关系图的TSV格式文件导出。运用R语言软件（Rx64 3.6.0）统计出每个基因邻接节点的个数并排序。并对邻接节点个数位于前三十名进行可视化。

1.6 基因本体（GO）分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

利用生物学信息注释数据库（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）对预测出的THYD治疗KOA的靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 THYD 活性成分

运用 TCMSP 数据库，根据OB和DL等参数初步筛选后获得生物活性成分44个。其筛选的成分分布图见图1。

图1 THYD 成分分布图

2.2 KOA 的相关靶点

通过检索GeneCard和OMIM数据库，并进行合并剔除重复靶点得到KOA相关的基因靶点共1499个。

2.3 THYD 成分—KOA 的共同靶标基因

与THYD的102个潜在作用靶点进行交集，最终得到THYD靶点与KOA靶点的交集靶点51个。见图2。

图 2 THYD—KOA 共靶 Venn 图

2.4 THYD 成分-靶点-KOA 网络图

在上述研究基础上构建THYD活性成分-靶点-KOA网络图，详见图3。图中共涉及节点102个，边204个，圆形节点代表药对于疾病的共同作用靶基因，V型节点代表THYD的活性成分，菱形代表疾病KOA，三角形代表THYD。在活性成分-靶点-KOA网络图中，所有交集靶点都至少与两个以上的活性成分相连接，其中 IL—6（degree=40）、ALB（degree=39）、VEGFA（degree=38）、MAPK8（degree=36）、PPARG（degree=27）、RELA（degree=27）与活性成分连接度较高。所有活性成分都至少与2个以上作用靶点相连接，其中槲皮素（degree=43）、木犀草素（degree=20）、山奈酚（degree=19）、黄芩素（degree=14）以及 β—胡萝卜素（degree=11）的连接度较高，可能是THYD防治KOA的中重要活性成分。THYD中一个活性成分可对应多个靶标，一个靶标也可与不同的活性成分相对应；可见THYD防治KOA具有多成分、多靶点的特点。

图3 THYD 成分-靶点-KOA 网络图

2.5 蛋白互作网络（PPI）

网络拓扑学分析结果见图4，PPI网络共包含51个节点，190条边，平均Degree为7.45，其中节点表示靶点蛋白，每条边都表示靶点蛋白与蛋白之间的相互作用关系，边的粗细代表相互作用力强弱。根据拓扑学指标Degree数值大小筛选出Degree排名前5位的靶点分别为：MAPK8（degree=24），VEGFA（degree=22），CASP3（degree=20），ESR1（degree=19），IL6（degree=19）。

图4 蛋白互作网络（PPI）图

2.6 THYD 治疗 KOA 的 GO 分析（修改）

使用DAVID数据库对51个与治疗KOA相关的靶点进行GO富集分析，选取P＜0.001的结果，并按富集靶点数进行排序后进行可视化。富集靶点数越多，THYD越有可能通过调节该生物学过程来治疗KOA，由图5、图6可知，THYD治疗KOA的相关生物学过程共有59个条目，THYD防治KOA可能跟酮反应、细胞成熟、对紫外线的反应、对雌二醇的反应、氧化应激引起的细胞死亡、腺体形态发生、女性性分化、血管内皮细胞迁移的调控、氧化应激诱导细胞死亡的调控、细胞对氧化应激反应的调节这些生物过程有关。

2.7 THYD 治疗 KOA 的 KEGG 分析

通过 DAVID 数据库对THYD治疗KOA涉及的34个蛋白靶点在信号通路中的作用进行研究,根据P＜0.001得到相关通路，共富集38条通路,同时构建靶点-通路网络图。根据相关度排序，前5的通路分别是：NF-κB 信号通路，肿瘤通路，流体剪切应力与动脉粥样硬化通路，肿瘤坏死因子通路以及糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路。由图7、图8可见，THYD治疗KOA是通过不同通路间相互传递信号进行调节。

图5 GO 富集分析条形图

图6 GO 富集分析网络图

图7 THYD 治疗 KOA 信号通路富集分析网络图

图8 THYD 治疗 KOA 信号通路富集分析网络图

3 讨论

3.1 现代医学对KOA 的研究

目前对于KOA的病因探究尚未完全明了[1]，现有研究发现[20—22]，年龄是其最强风险因素，年龄增大意味着再生能力的下降以及风险因素的积累。此外，雌激素、骨密度、膝关节损伤、肥胖、遗传等都是罹患OA的风险因素。由于发病机制不完全明确，口服药物具有一定的副作用，临床上对于OA的防治尚无理想的疗法[2]。

3.2 祖国医学对KOA 的研究

KOA在在古代中医学中并无具体病名，一般将本病归入“痹证”“骨痹”范畴。对于膝痹的病因病机，历代医家总结认为是以肝肾亏虚为本，风寒湿邪外侵为标：肝主筋，肝亏导致筋脉松弛，肾主骨，肾虚则骨质松软滋生赘物，加上活动时不慎扭伤关节或者赘物与筋肉摩擦产生瘀血，又遭受风寒湿热邪气的入侵，诸因阻碍关节屈伸，发为痹痛。《类证治裁·痹证》说：“痹久必有瘀血”。而清代王清任亦于《医林改错· 卷下》中明确提出了“瘀血致痹”的病理机制。有现代研究受中医“血瘀”理论启发，通过结扎动物臀下静脉、股静脉及大隐静脉8周后，成功造出早中期膝关节骨性关节炎动物模型[23]。综上可知，瘀血与KOA的病因有密切的联系。《本草经疏》云，“桃仁，性善破血。”《本草汇言》曰，“红花，破血、行血、和血、调血之药也。”桃仁、红花作为活血化瘀的经典药对，在现代治疗KOA中亦多有运用[14—15]。也有现代药理研究文献报道，桃仁可以改善血流动力学、抗炎镇痛以及抗敏、抗肿瘤[24]；而红花具有抗炎、抗血栓形成的作用[25]。上述文献对于THYD治疗KOA的机制都有借鉴意义。然而目前的药理研究尚缺乏对THYD治疗KOA的机制系统、全面的阐释。

3.3 网络药理学能阐释THYD 治疗KOA 可能的作用机制

网络药理学是系统生物学的重要组成部分，其整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的基本特点相吻合，是一门从系统层面揭示中药对机体调控网络作用的新兴学科，为研究传统中药与现代药理学之间的相互关系搭建了桥梁[26]。本研究运用网络药理学系统地从分子水平层面上发现THYD治疗KOA潜在的化学成分以及阐释可能的作用机制。

通过上述网络药理学研究可知，THYD主要化学成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄芩素以及β—胡萝卜素等。其中有研究发现[27]，黄芩苷可通过对实验用的骨关节炎大鼠模型的肌肉氧化应激进行抑制，以减轻关节疼痛。本研究通过初步筛选获得THYD中生物活性成分44个，并在此基础上利用最终得到的22个生物活性成分，挖掘出102个可能的靶点和 204 个相互关系。根据药效成分—靶点—疾病网络图分析显示，β—胡萝卜素、木酚素、木犀草素、槲皮素等有效成分能作用于网络中的多个靶点，白细胞介素6（IL6）、雌激素受体 α（ESR1）、雄激素受体（AR）等靶点也能与多个成分形成作用关系。THYD的药效成分之间联系紧密，而且其作用的靶点也在KOA的发展进程中发挥着很大程度的作用。

对GO富集结果进行讨论：在富集靶点数排名前5的生物学过程中分别是：酮反应、细胞成熟、对紫外线的反应、对雌二醇的反应、氧化应激引起的细胞死亡。张恩尉[28]等通过实验证实了雌二醇可通过与雌激素受体β 结合抑制骨关节炎滑膜细胞的 NF-κB通路从而发挥抗炎作用；目前有研究表明[29]，氧化应激过程在骨性关节炎中发挥着重要的作用，氧化应激过程中能产生大量的损伤关节软骨基质、导致关节软骨细胞形态改变的自由基及炎症因子。其余生物学过程尚未有文献发现其与骨性关节炎的联系，这从侧面反应出THYD治疗KOA的生物过程极为复杂。

对KEGG通路富集结果进行讨论：THYD主要通过调节肿瘤、细胞凋亡、炎症、糖尿病相关等38条信号通路而发挥治疗KOA的作用。本研究决定对相关程度前5名的通路展开探讨。NF—kappa B信号通路：有研究表明，NF-κB 信号通路在软骨细胞的促炎应激反应中的众多通路中处于核心位置[30]，其中，促炎细胞因子、趋化因子、应激因子和细胞外基质的降解产物可激活NF-κB 蛋白，在刺激之下，NF-κB 分子被进一步激活，诱导一系列造成关节软骨破坏的基因表达，导致骨关节炎的发生和发展[31]；肿瘤通路：目前尚无文献报道该通路与KOA的相关性；利用Rndsystems网站（https://www.rndsystems.com/cn）查询“cancer pathways”以及查阅相关文献[32]可知低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路与肿瘤通路关联性高且处于本研究KEGG通路图中第9位。有相关研究[33]证实，增加 HIF-1α 的活性能够诱导热休克蛋白70（HSP70）的过度表达并增强细胞外基质的表达水平，从而防止软骨细胞的凋亡；流体剪切应力与动脉粥样硬化通路：有文献[34]表明动脉粥样硬化跟骨性关节炎有一定的联系，但尚无确切的实验证据证实两者联系的密切性。目前尚无研究支持该通路与骨性关节炎的相关性；肿瘤坏死因子通路：有研究发现，肿瘤坏死因子α 通过抑制软骨基质合成、诱导基质金属蛋白酶产生，在膝骨关节炎的软骨破坏中发挥重要作用[35-36]；糖尿病并发症的AGERAGE信号通路：有相关研究报道并证实，晚期糖基化终末产物（AGE）可以与软骨细胞膜上RAGE结合，对一系列细胞内的信号通路进行激活，进而导致白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13的表达增加，这是晚期糖基化终末产物导致骨关节炎病变的主要途径[37]。

4 结论

本研究通过构建成分-靶点-疾病关联网络、PPI网络以及进行GO和KEGG分析,发现桃仁-红花药对中的活性成分可能是通过调控体内雌激素抑制滑膜细胞进行抗炎；通过抑制软骨细胞的氧化应激反应对膝关节软骨进行保护；通过NF-κB信号通路、肿瘤坏死因子通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路，分别对NF-kB因子、白细胞介素1、肿瘤坏死因子α 、基质金属蛋白酶13等炎性因子的表达进行抑制从而抑制炎症反应以及减少对软骨的破坏。充分说明桃仁-红花药对治疗膝骨关节炎的机制具有多成分-多靶点-多层次-多通路的特点。

5 展望

经以上网络药理学的探索可知，桃仁-红花作为活血化瘀的经典药对，在治疗“痹证”的作用机理具有一定的药理依据。有相关研究表明[38]，瘀血跟炎症具有密切的关系，血清白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎性因子都参与了血瘀证的形成。而THYD对IL—6通路、TNF通路都具有调节作用。可以通过药理学实验进一步探究THYD或者在中医角度上以活血化瘀为主的复方对KOA的消炎作用。

现代研究发现二仙汤加味对去卵巢大鼠的血清雌二醇（E2）有提升作用[39],而雌二醇可通过与雌激素受体β 结合以抑制骨关节炎滑膜细胞的 NF-κB 通路从而发挥抗炎作用[28]，由网络药理学的生物学过程分析可知THYD有通过调节雌二醇治疗KOA的可能。这为药理实验进一步探究THYD的调节雌二醇的可能性以及临床上二仙汤的组方都提供了研究方向与思路。

中医学认为，老年膝骨关节炎最常见为肝肾亏虚型。有研究认为，随着年龄的增加，体内会有大量晚期糖基化终末产物的产生和堆积，而晚期糖基化终末产物是骨关节炎年龄致病因素的分子学基础[40]。由本研究的KEGG通路富集分析可知，THYD可能通过调节AGE-RAGE信号通路对KOA产生治疗作用。因此进一步探究肝肾亏虚证型与晚期糖基化终末产物的联系以及通过药理学实验探究THYD对晚期糖基化终末产物的调节作用也有一定的意义。

本研究期望能为今后的关于本药对的药理实验提供一定的文献基础及重要的理论依据，同时为今后中医临床上的组方以及药理实验提供更多有意义的方向与思路。