不同颜色大豆种皮色素含量的分析

张 豪 ，武国瑞 ，杨万明 ，杜维俊 ，赵晋忠 ，岳爱琴 ，张永坡 ，高春艳 ，王 敏

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.晋中学院生物科学与技术学院，山西晋中030600；3.山西农业大学文理学院，山西太谷030801）

天然食用色素作为一类重要、较为安全的食品添加剂，应用于食品已有几个世纪的历史[1]。其中，花色苷、原花青素、黄酮、类胡萝卜素和叶绿素因其营养与保健功能而被广泛应用[2-4]，这在当今社会愈加明显。大豆种皮富含有丰富的颜色，如黄色、绿色、棕色和黑色[5]，可以作为一种或多种天然色素的潜在来源。大豆种皮相比于胚和子叶，拥有更多的色彩，研究意义更大。本研究以16份不同颜色大豆种子为材料，从种皮色素含量和种皮颜色指标方面，利用相关分析、主成分分析、聚类分析对不同大豆品种种皮色素指标进行综合评价，以期为大豆品质育种及品质资源鉴定与筛选提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

表1 供试大豆品种及种皮颜色

大豆种皮色按标准分成5类，但是实际种皮颜色是渐变的。通过野生与栽培大豆杂交构建的重组自交系群体后代可表现出种皮颜色连续的渐变。本研究选取13份重组自交系群体后代（JP）和3份纯色（黄、绿、黑）大豆资源为试验材料（表1），共计16份材料，几乎涵盖了所有可能的大豆种皮色。各品种种子均在山西农业大学农作站进行繁育。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆种皮色的测定 采用WSC-80C全自动色差计测量大豆种皮的颜色。每个品种随机选取5粒，用种皮的中间部分对准色差仪的集光孔进行测量，最后取平均值。色度（C）＝（a＋b）1/2，C值表示到亮度轴上的距离，即距离越远，C值越大[6-7]。

1.2.2 大豆种皮色素含量的测定 手工剥取各大豆种皮，冷冻干燥后粉碎过0.25 mm筛，然后加入20 mL石油醚振荡脱脂24 h，最后放于4℃冰箱中储藏备用。采用pH示差法测定种皮的花色苷含量[8]。采用Al（NO3）3络合分光光度法测定种皮总黄酮的含量[9]。利用香草醛-盐酸法测定种皮的原花青素含量[10]。参照文献[11]测定种皮的类胡萝卜素含量[11]。参照文献[12]测定种皮的叶绿素含量。

1.3 数据分析

利用SPSS软件对各色素指标数据进行显著性分析、主成分分析、聚类分析和相关性分析，并计算F值。

2 结果与分析

2.1 不同种皮色大豆色素含量的比较分析

表2 不同种皮色大豆色素含量的差异

由表2可知，9个性状均在品种间存在显著差异，且达到极显著水平（P＜0.01）。16份大豆品种中，SZ874种皮中的花色苷含量最高，达到10.27 mg/g，且与其他种皮色大豆达到了显著差异，其种皮的L值、a值、b值和 C值很低，分别为 21.05、-2.11、1.36和2.58，使该种皮色呈现为黑色哑光。JP381的花色苷含量较高，达到6.92 mg/g，与除SZ874外其他种皮色大豆达到了显著差异，种皮表现为亮黑色。花色 苷 含 量 较 小 的 品 种 有 JP394、JP400、JP331、JP356，花色苷含量依次下降且互相之间均差异显著，其余大豆花色苷含量极少，互相之间差异不显著，且PB2438种皮中完全检测不到花色苷，但是其种皮的L值、b值和C值却达最高，分别为56.96、32.98和34.76，该种皮色为黄色，表明黄色大豆中不含花色苷。与花色苷趋势相同，SZ874种皮原花青素的含量亦最高，与其他种皮色大豆达到了显著差异，原花青素较高的有 JP381、JP357、JP360、JP372、JP394和JP331，且相互间差异达显著水平，其余9个大豆品种的原花青素含量极低，在0～0.50 mg/g，PB2438种皮亦检测不到原花青素。16个大豆品种的总黄酮差异十分明显，其中，以JP357、JP381、SZ874和JP360种皮的总黄酮含量较高，均在100 mg/g以上，亨特指标值相对偏低，这4个品种的种皮为红棕色或黑色，表明颜色深的大豆品种总黄酮含量较高；JP394、JP400、JP372、JP331 和 JP374的总黄酮含量居中，在15.92～71.31 mg/g，它们的种皮颜色大多为棕色，其余7个大豆品种的总黄酮含量则相对较低，均不超过12 mg/g，这些大豆种皮颜色较浅，亨特指标中L值比较大，均在30以上，可见种皮颜色和总黄酮含量呈正相关关系，基本是种皮颜色越深，越暗沉，总黄酮含量越高的趋势。各大豆品种的类胡萝卜素含量在2.90～10.30mg/100g，其中JP392、SZ874的含量最高，种皮色为黑黄色，与其他材料差异显著，其次为JP357和JP394，种皮色为棕褐色，JP373的含量最低。叶绿素含量最高的为JP392，与其他材料差异显著，其次为JP372和JP374，PB2438和JP400的含量极低，只有0.05mg/g。综上所述，种皮颜色和各色素含量之间有着密切的关系。

2.2 不同色素含量的相关分析

从表3可以看出，大豆种皮花色苷含量、原花青素和总黄酮含量3个指标间均呈极显著正相关关系，表明3个指标受相同基因的控制或具有相同的代谢途径。此外，类胡萝卜素含量与原花青素含量和叶绿素含量呈显著正相关关系。L值与b、C值呈极显著正相关关系，与原花青素和总黄酮含量呈极显著负相关，与花色苷和类胡萝卜素含量呈显著负相关，表明大豆种皮越黯淡，其原花青素和总黄酮含量越高，种皮越有光泽，花色苷和类胡萝卜素含量越低。b值与C值呈显著正相关，且b值跟C值都与花色苷含量、原花青素和总黄酮含量呈显著或极显著负相关关系，表明大豆种皮越黄，其原花青素、花色苷和总黄酮含量越低。a值只与花色苷含量呈显著负相关。

表3 色素指标间的相关性分析

2.3 不同色素含量的主成分分析

对16份大豆品种的9个指标进行主成分分析，结果发现前4个主成分的方差贡献率累积达到95.92%，这说明这4个主成分可以代表9个指标的大部分信息（表4）。在主成分1中，花色苷含量、原花青素含量和总黄酮含量具有正向载荷，L值、b值和C值具有负向载荷，且这6个指标载荷系数的绝对值较大，说明花色苷含量高、原花青素含量高、总黄酮含量高、种皮色泽黯淡、种皮偏深色，颜色饱和度低是第1主成分的主导因子，有利于大豆种皮品质改良。而在主成分2中，类胡萝卜素含量、叶绿素含量和a值的载荷系数绝对值较大，均为正向载荷，主要表现为类胡萝卜素含量多、叶绿素含量高和种皮颜色偏绿，是第2主成分的主导因子。第1主成分和第2主成分中涉及的主导因子覆盖全部9个指标，说明这2个主成分具有可靠的代表性。在主成分3中，总黄酮含量、类胡萝卜素含量、叶绿素含量和a值的载荷系数较大，是第3主成分的主导因子，其中，总黄酮含量和a值是正向载荷，类胡萝卜素含量和叶绿素含量是负向载荷。说明总黄酮含量高、种皮色泽黯淡、种皮偏绿、类胡萝卜素含量和叶绿素含量低是第3主成分的主导因子。第4主成分的主导因子是花色苷含量、原花青素含量、L值、a值和b值，它们对第4主成分均为正向载荷。这表现为花色苷含量高、原花青素含量高、种皮色泽黯淡、种皮偏黄绿是第4主成分的主导因子。

表4 色素含量的主成分分析

2.4 不同种皮色大豆的聚类分析

针对种皮的9个指标，对其综合指标进行聚类分析（图1），且在欧式距离2.00处将16份大豆品种分成 4 类，第一类：JP374、JP392、JP372、JP331 和JP419，该类大豆种皮色颜色较浅或呈双色；第二类：JP356、SP44、JP373、JP375 和 PB2438，该类种皮颜色较浅，均为黄绿色；第三类：JP400、JP394、JP357和JP360，该类大豆种皮均呈棕褐色；第四类JP381和SZ874（图1），该类种皮均为黑色。

2.5 不同类型大豆色素含量的特征分析

基于聚类分析的结果（表5），对不同颜色种皮色素含量分析发现，第四类大豆花色苷和原花青素含量极显著高于其他三类大豆，表现为黑色种皮，这表明黑豆相比于其他颜色大豆而言，是更好的花色苷与原花青素来源。而对于总黄酮含量来说，第四类大豆显著高于第三类，且第三类和第四类大豆极显著高于第一类和第二类大豆，这表明种皮色越深，总黄酮含量越高。从类胡萝卜素含量看，第二类大豆显著低于其余三类，但没有达到极显著水平，这表明相对于黑豆与棕褐色豆而言，黄豆与绿豆种皮的类胡萝卜素含量更低。第一类大豆的叶绿素含量显著高于其他三类，但只与第二类达到极显著差异，第一类大豆除JP372外均带绿色，这表明在大多绿色种皮大豆中叶绿素含量要高于其他颜色种皮大豆，但也有极少数绿豆叶绿素含量极低。

表5 不同类型大豆色素含量的特征分析

3 结论与讨论

颜色是遗传研究中最早的评估特性之一，起源于孟德尔所进行的工作。20世纪初，孟德尔的遗传定律被世人所公认，此后在大豆中进行的遗传研究大多与颜色特征相关。大豆种皮色在从野生大豆到栽培大豆的演变过程中逐渐从黑色变成黄色，是重要的形态标记，因此，大豆种皮色素的研究无论是对进化理论研究还是种子育种实践都具有非常重要的意义。目前，世界各地关于大豆色素的研究有很多，但大多只研究了其中1种或2种[13-15]。大豆种皮色彩丰富，这些色彩的呈现可能包含其他色素，因此，对种皮色素的研究还需更加全面。本研究在前人研究的基础上，分析不同颜色种皮的5种色素含量及相关关系，能够为大豆种皮色素的发掘提供一定的参考。

色素含量虽与遗传有关，其遗传机理尚需进一步研究。但本研究表明，在大豆育种中，进一步加强对种皮色素含量的选择是有效的。不同颜色的大豆其色素含量差异十分显著，以花色苷、原花青素和总黄酮最为明显，主要集中在黑豆及棕褐色豆这些颜色较深的品种，浅色种皮中含量较少，表明这三类色素可能是在大豆的驯化过程中，其表皮由深到浅的变化过程中流失的。在16个大豆品种中，均检测到有叶绿素，而在大豆籽粒形成到成熟过程中，种皮由绿转变为各自本身的颜色，这表明在大豆成长发育过程中，叶绿素一直存在于大豆种皮中，但不同时期含量的变化还需进一步研究。各品种均检测出类胡萝卜素，而种皮类胡萝卜素能保护其种子中的不饱和脂肪酸，为下一代的繁衍储备能量，这与YUKI等[16]的分析结果一致。大豆种皮光泽度低，使大豆表皮呈现出哑光，这尤其以黑豆最为明显，使得其表皮大多形成泥膜。本次研究发现，无论何种颜色大豆，其各类色素含量均与亮度呈反比，孙奇泽等[17]在研究彩色花生种皮色素时得出一致的结果。

有研究表明，种皮颜色与色素含量有显著相关性。罗体英等[18]研究发现，黄籽油菜种子中与种皮颜色有显著相关性的色素是花色苷。而郝志等[19]研究表明，彩色小麦中色素含量最高的是蓝紫色小麦，而白色小麦色素含量最少。本研究结果表明，与种皮颜色有关的种皮色素为花色苷、原花青素、总黄酮、叶绿素和类胡萝卜素。种皮颜色越深，种皮色素含量越高。这与DJORDJE等[20]的研究结果一致，色素含量测定较繁琐，根据种皮颜色与色素含量的相关性，对大豆种皮色合理划分等级，为今后按颜色筛选不同色素种子提供了依据。

由于大豆产品的广泛使用，以大豆种皮色素为基础的营养补充剂由于含有大量的天然抗氧化活性物质，可用于功能性食品或制药原料。本研究表明，与普通大豆（即黄、绿种皮大豆）相比，黑色和棕色种子的品种可能是更好的天然抗氧化剂来源。