天智颗粒对慢性脑缺血大鼠脑组织Drebrin表达的影响

李 林

慢性脑缺血起病隐匿，早期症状容易受忽视，最终可导致学习记忆功能障碍、脑白质损伤、神经元变性等，严重影响患者生活质量，加重家庭经济负担，但慢性脑缺血早期是可逆的，因此及时发现疾病并在发病早期给予干预可阻止疾病进展。近年来大部分研究显示，中药对脑血管病所致的大脑功能障碍有很好的治疗效果，其中天智颗粒是根据我国古老的中药组方天麻钩藤饮研制的一种药物，临床研究显示天智颗粒有较好地改善认知功能的效果［1］。但目前对于天智颗粒改善大脑功能的机制研究尚不充分。因此，笔者通过双侧颈总动脉永久性结扎（2VO）建立大鼠慢性脑缺血模型，通过水迷宫实验观察天智颗粒对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力影响，免疫组化方法检测天智颗粒对脑组织Drebrin的表达影响，探讨天智颗粒改善大脑功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级健康成年无视力缺陷的Wistar大鼠80只，雌雄不限，体重300 g左右，由郑州大学医学院动物中心提供。随机分为4组：正常对照组，假手术组，模型组，天智颗粒治疗组，每组20只。

1.2 试剂与仪器 天智颗粒（宛西制药有限公司）、山羊抗Drebrin多克隆抗体（Santa Cruz公司）、山羊PV-9003免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）、浓缩型DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）、Morris水迷宫仪 （中国医学科学院药物研究所）等。

1.3 动物模型制作 双侧颈总动脉永久性结扎（2VO）建立大鼠慢性脑缺血模型，大鼠手术前禁食12 h，禁水4 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉，丝线双重结扎双侧颈总动脉。术后大鼠均置于原通风的动物房喂养，给予足够的食物和水。假手术组不结扎双侧颈总动脉，余处理同模型组大鼠。正常对照组不予手术处理。

1.4 给药方法 治疗组于手术后次日开始每天给予天智颗粒（5 g/kg）灌胃，模型组和假手术组分别给予蒸馏水（5 g/kg）灌胃，正常对照组不作任何处理。

1.5 大鼠学习记忆能力检测 各组大鼠在灌胃4周后用Morris水迷宫实验进行学习记忆功能检测。Morris水迷宫实验包括定位航行试验和空间探索实验两部分。其中定位航行试验历时5 d，每天训练4次，大鼠寻找到隐藏在水面下的可移动平台的时间称为逃避潜伏期（escape latency）。水迷宫的平台位于西南象限，每次采用不同的入水点，每次训练120 s。若大鼠在120 s内不能找到平台，则将其诱导到平台上停留10 s；若大鼠在规定时间内找到平台，则让其在平台上停留10 s，结束一次训练。各组大鼠训练5 d，分别记录第5天每只大鼠的逃避潜伏期进行统计学分析。大鼠的逃避潜伏期越短说明大鼠的学习记忆功能越好。

空间探索实验是在定位航行试验后去除平台，然后任意选择一个入水点将大鼠放入水池中，记录大鼠在一定时间内的游泳轨迹，检测大鼠对原来平台位置的记忆能力。第5天进行空间探索实验，撤去平台，记录120 s内大鼠穿越原来平台位置的次数。大鼠穿越原来平台区的次数越多说明大鼠的学习记忆功能越好。

1.6 免疫组化染色 各组大鼠学习记忆功能检测结束后，常规灌注取大脑组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋切片。按PV免疫组化操作。阴性对照由PBS代替一抗。每只动物取5张切片，每张切片高倍镜下选取4个不同视野，计数每一个视野中的阳性细胞数，计算平均数。

1.7 读片及统计学分析 所有实验数据以（x±s）表示，用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较应用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠学习记忆能力检测结果 统计结果显示，定位航行实验显示，与正常对照组逃避潜伏期相比，假手术组大鼠变化差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05），说明模型组大鼠学习记忆功能明显受损；与正常对照组相比，治疗组大鼠逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比较，治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05），提示天智颗粒有效改善大鼠的学习记忆功能。见表1。

表1 各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期比较（x±s）

空间探索实验显示，正常对照组与假手术组大鼠固定时间内穿越原平台的次数均较多；与正常组比较，模型组大鼠穿越平台的次数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比较，治疗组穿越平台的次数增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠Morris水迷宫穿越平台次数比较（x±s）

2.2 大鼠脑组织Drebrin免疫组织化学结果Drebrin免疫组化阳性细胞为胞质中棕黄色颗粒，主要分布在轴突和树突中。正常对照组及假手术组大鼠脑组织中Drebrin阳性细胞均较多，与正常组比较，假手术组大鼠脑组织中Drebrin阳性细胞无变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常组比较，慢性脑缺血模型组的Drebrin阳性细胞明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比较，治疗组表达Drebrin的阳性细胞数增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见图 1、表 3。

下图1：李 林.天智颗粒对慢性脑缺血大鼠脑组织Drebrin表达的影响（正文356～359，362页）

图1 各组大鼠脑Drebrin免疫组化染色结果（DAB染色，×200）

表3 各组大鼠脑组织Drebrin阳性细胞数比较（x±s）

3 讨论

大脑发育调节蛋白（Drebrin），主要有Drebrin A（成年型）和Drebrin E（胚胎型）两种亚型，是树突棘纤维状肌动蛋白（F-actin）的固有结合蛋白之一，在脑内高度表达。Drebrin介导F-actin和神经微管的相互作用，调控F-actin的分布，调节肌动蛋白骨架的结构形态［2］，同时Drebrin调控轴突细胞骨架结构，促进轴索侧枝的形成［3］。Drebrin的表达也可以减少 Ca2+内流，避免 Ca2+超载引起树突棘结构破坏［4］。在神经元发育过程中抑制Debrin A的表达，会抑制F-actin和PSD-95的聚集，进而抑制树突棘的形成［5］。如果在神经元发育时期抑制Drebrin A表达，将导致树突棘的成熟障碍及树突棘的形态和数目异常［6］。成熟神经元细胞过表达Drebrin A引起树突棘的伸长［7］。Kreis等的研究发现Drebrin基因敲除神经元树突棘的易损性是增加的［8］。抑制发育中海马神经元Drebrin A表达，引起丝状伪足密度减小和宽度缩小［9］。在树突棘中，Drebrin A的聚集促进肌动蛋白结构从线状变为分枝状［10］，而树突棘形态的变化即突触可塑性对于学习、记忆起着重要作用［11］。Drebrin和F-actin形成稳定的复合物是完成长时程突触电位维持的关键，从而增强学习和记忆能力［12］。因此目前研究认为，Drebrin在树突棘可塑性［13］和大脑高级 功能 如学 习 和记 忆 方面［14］起到重要作用，而且Drerbin在维持长时程记忆的生理过程中起到关键性的作用，其在神经元细胞迁移、突触发生和突触重塑也发挥着重要作用［15］。

慢性脑缺血因血管狭窄或血液动力学、血液流变学等因素导致脑血流量降低而出现脑慢性缺血缺氧改变。正常脑血流量约为50～55 ml/100 g·min，当脑血流量低于8 ml/100 g·min时，即可出现细胞膜破坏进而导致细胞死亡以及永久性神经坏死［16］。在急性脑缺血灶周围树突棘数量可减少38%［17］。大鼠幼年时药物造成脑缺血损伤，6个月后发现大鼠脑组织树突棘明显减少［18］。阻断大鼠一侧大脑中动脉后，在缺血区域，树突棘密度明显降低［19］。大脑中动脉阻断模型中脑缺血后7 d海马CA1区Drebrin表达是减少的［20］。与正常对照组相比，全脑缺血模型大鼠海马CA1区分枝状树突棘明显减少、树突棘密度明显降低［21］。该研究发现大鼠慢性脑缺血后脑组织Drebrin表达减少，认知功能障碍，因此推测慢性脑缺血后Drebrin表达受抑制，导致树突棘数量和形态改变，进而导致认知障碍。

慢性脑缺血的发病机制复杂，包括胶质细胞增殖活化、氧化应激反应、细胞凋亡、突触改变、神经递质紊乱等［22-24］，慢性脑缺血导致的脑损伤早期主要表现为认知功能损害，最终发展为持久或进展性的认知与神经功能障碍，因此在疾病早期针对发病机制给予干预，可更有效预防慢性脑缺血疾病进展。天智颗粒是由中药天麻钩藤饮加减制成的方剂，它的主要成分为：天麻、钩藤、石决明、杜仲、桑寄生、茯神、首乌藤、槐花、栀子、黄芩、川牛膝、益母草。目前对天智颗粒组分之一天麻的提取物天麻素的研究较多，而其他成分研究甚少。体外实验证明，天麻素减少兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤，促进神经干细胞的分化［25］。目前研究表明，天麻素具有抗氧化、清除自由基、抗兴奋性毒性损伤、抑制缺氧时神经元细胞内Ca2+和NO的异常升高［26］、稳定细胞膜、抑制细胞凋亡等神经保护作用［27］和改善记忆力作用［28］。该研究结果显示，与2VO模型组相比，天智颗粒治疗组大鼠的行为学实验证明天智颗粒治疗后大鼠的学习记忆功能明显改善，说明天智颗粒减少慢性缺血对大鼠脑神经元的损伤。与模型组相比，天智颗粒治疗组大鼠脑组织Drebrin的表达升高，有统计学意义（P＜0.05），推测天智颗粒能促进慢性脑缺血大鼠神经元中Drebrin的表达，减少慢性缺血导致的神经元树突棘的破坏，进而改善慢性脑缺血所致的认知障碍，但是天智颗粒的神经保护作用机制仍不清楚，并且作为一个古老的中药复方制剂，具体发挥神经保护作用的成分亦不清楚，有待进一步的深入研究。