白茶提取物对纳米SiO2诱导的大鼠肺纤维化的抑制作用及机制

朴秀美，金恩惠，陈兴华，王千潮，何普明*，屠幼英*

白茶提取物对纳米SiO2诱导的大鼠肺纤维化的抑制作用及机制

朴秀美1，金恩惠1，陈兴华2，王千潮3，何普明1*，屠幼英1*

1. 浙江大学茶学系，浙江 杭州 310058；2. 福鼎市茶业发展领导小组，福建 福鼎 355200；3. 福鼎市茶业管理局，福建 福鼎 355200

硅肺是吸入SiO2粉尘引起的以肺间质纤维化为主的全身性疾病。探讨了白茶提取物对纳米SiO2诱导大鼠肺纤维化的抑制作用及机制。54只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、白毫银针提取物组、白牡丹提取物高和低剂量组、EGCG组共6个组，每组9只大鼠。除正常组外的其余5个组采用非暴露式气管插管方法造模纳米SiO2粉尘（80 mg·mL-1），每天以灌胃方式给予药物两周之后，检测肺组织中羟脯氨酸（HYP）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷光甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量以及肺组织形态学变化。结果显示，与模型组相比，白茶提取物各处理组及EGCG组病理形态改变有不同程度的减轻，其中白毫银针提取物组的效果最佳。白茶提取物各处理组与EGCG组的大鼠肺NO含量和炎症因子IL-6都显著低于模型组（＜0.05），GSH-Px活力高于模型组（＜0.05），高剂量白牡丹提取物对降低NO含量和升高GSH-Px活力效果最好；本研究表明，白茶提取物对于纳米SiO2引起的大鼠肺纤维化氧化应激损伤具有有效的减缓和修复作用，主要与其抗氧化作用和抑制炎症反应相关。

白茶提取物；纳米SiO2；大鼠；肺纤维化；抑制作用；修复

纳米SiO2是指超细纳米级的SiO2，粒径在1~100 nm间的物质颗粒[1]，具有分散性好、化学纯度高、不溶于水、低热导性、高磁阻性等[2]独特的性质，可提高抗紫外线的光学性能、材料的抗老化、强度、耐久性，因此目前作为世界上大规模工业化生产产量最高的纳米粉体材料之一。它主要用于建筑、航空航天、医药、电子封装材料、树脂复合材料、塑料、涂料、化妆品、橡胶、陶瓷、玻璃钢制品等。由于大规模生产和纳米产业的日益发展，纳米SiO2在日常生活中广泛存在，人们接触到纳米材料的概率越来越高，以致无法避免纳米SiO2通过各种不同途径进入人体。

大量的研究证明，SiO2能导致呼吸道疾病硅肺。在1996年10月，国际癌症研究机构（International agency for research on cancer，IARC）宣布将SiO2升级为第一类人类致癌物质。纳米SiO2与微米SiO2化学组成相同，但是纳米SiO2潜在更大的危害。对于纳米SiO2的毒性，赵光强等[3]比较研究了微米SiO2与纳米SiO2对人支气管上皮细胞的破坏性，结果显示，微米SiO2没有进入细胞里，而纳米SiO2可以进入细胞，并赋存细胞质中。另有研究表明[4]，纳米SiO2的粒径越小，颗粒表面能和比表面积越大，纳米SiO2的反应活性越大。高艳荣等[5]进行动物实验表明，纳米SiO2导致的氧化损伤比微米的更严重，颗粒的大小与损伤程度呈现一定的负相关。因此，如何通过健康生活方式降低环境中纳米SiO2对人体呼吸系统的毒害，从而降低癌症发病率显得非常迫切和重要。

中国具有悠久的饮茶历史，茶叶是重要的天然酚类抗氧化剂来源[6]，其中白茶的抗氧化和杀菌效果较佳。因此，本研究以白茶提取物为研究材料，探讨白茶提取物在动物体内对纳米SiO2染毒大鼠肺损伤的抑制作用和修复机理，为减少环境纳米SiO2等有害物质引发的疾病提供一定的科学方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

健康雄性Wistar大鼠54只，体重260~300 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.1.2 主要试剂

纳米SiO2（99.5% trace metals basis，粒径大小5~15 nm）购自美国Sigma公司；白毫银针和白牡丹由福建鼎白茶业有限公司无偿提供；EGCG（Epigallocatechin gallate）购自湖州荣凯植物提取有限公司，纯度95%。SOD试剂盒、MDA含量检测试剂盒、GSH-Px活力检测试剂盒、NO含量检测试剂盒、蛋白定量检测试剂盒，羟脯氨酸碱水解法测试盒均购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素6（IL-6）检测ELISA试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司；其余均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器

MLS-3750高压灭菌罐（SANYO）、JJ-12J脱水机（武汉俊杰电子有限公司）、JB-P5包埋机（武汉俊杰电子有限公司）、RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）、JB-L5冻台（武汉俊杰电子有限公司）、KD-P组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）、DHG-9140A烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司）、10212432C载玻片及盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）、Nikon Eclipse CI正置光学显微镜（日本尼康）、Nikon DS-U3成像系统（日本尼康）、AL 104 电子天平（Mettler Toledo）。

1.3 试验方法

1.3.1 白茶提取物制备

将白毫银针和白牡丹样品分别用粉碎机磨碎。称取一定质量的白茶，按1∶30，1∶20，1∶20茶水比100℃沸水分3次浸提，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约1/10之后，将浓缩液放入–20℃冰箱冷冻后，通过冷冻干燥制成冻干粉，–20℃冰箱保存备用。

1.3.2 建立纳米SiO2诱导致大鼠肺纤维化模型

Wistar大鼠造模采用非暴露式气管内注入法。正常组经气管一次性注入与造模组等量生理盐水，其他各组经气管一次性灌肺80 mg·mL-1的纳米SiO2悬液0.01 mL·kg-1，注药后，立即将动物充分直立旋转，使药物在肺内分布均匀，等待两周建模时间。

1.3.3 试验动物分组及给药

除正常对照组（NC）9只大鼠之外，其他45只大鼠造模两周后，按体重随机分为5组，即模型组（MC）、白毫银针提取物组（1 000 mg·kg-1·d-1，BHYZ）、白牡丹提取物高剂量组（1 000 mg·kg-1·d-1，HBMD）、白牡丹提取物低剂量组（300 mg·kg-1·d-1，LBMD）、EGCG组（150 mg·kg-1·d-1），共6组。每组9只，分笼饲养，每笼4~5只，自由摄食和饮水。用生理盐水配制白茶提取物及EGCG溶液，采用灌胃的方式按分组给药，每天1次，每次每只大鼠按体重灌胃（1 mL·kg-1）。正常组和模型组给予按体重换算的生理盐水，分别再连续灌胃两周。

1.3.4 大鼠肺标本和组织处理

肺组织的采集：将大鼠用巴比妥钠麻醉后，心脏穿刺取血收集全血，大鼠处死后，开胸取出肺组织，用预备生理盐水清洗掉肺组织表面的血污，再以滤纸擦干水分后称重并记录质量、用照相机拍照，尽量迅速进行上述操作后随即将组织存于–80℃保存。把修块一部分的肺组织立即放入4%多聚甲醛中保存，用于HE染色的制备。

肺组织、肝组织匀浆的制备：按照准确的比例重量，称取肺组织或肝组织，按质量（g）：体积（mL）=1∶9的比例添加相应体积的生理盐水，放入匀浆器中，为了便于匀浆，首先用剪刀剪碎组织，再次在冰水浴中进行组织匀浆，4 000 r·min-1，离心10 min，取出10%匀浆上清液作为母液，配成不同稀释浓度测定生理指标及炎症因子。

1.3.5 大鼠形态学观察

HE染色后，显微镜下观察各组大鼠肺组织的形态结构以及肺纤维化水平。大鼠肺纤维化采用Ashcroft评分八级分类法，具体标准如下：0级为正常肺组织；1级为肺泡或细支气管壁轻微纤维性增厚；2级为介于1级与3级之间；3级为中度肺泡或细支气管壁纤维性增厚，无明显肺组织结构破坏；4级为介于3级和5级之间；5级为纤维化增强伴有明确的组织结构破坏，纤维束或纤维团块形成；6级为介于5级与7级之间；7级为肺组织结构严重破坏，大的纤维化区域形成，可伴蜂窝肺形成；8级为整个肺组织区域纤维性闭塞[7]。

1.3.6 肺组织生理指标和炎症因子检测

SOD、MDA、GSH-Px、NO、蛋白定量、羟脯氨酸测定按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒方法；炎症因子白细胞介素6（IL-6）检测采用ELISA方法，参照武汉基因美生物科技有限公司试剂盒方法。

1.4 统计学分析

2 结果与分析

2.1 白茶提取物对纳米SiO2诱导的大鼠肺形态学的影响

2.1.1 大鼠各处理组肺组织肉眼观察结果

肺组织形态学观察结果显示，正常组大鼠肺组织呈粉红色，湿润，质地柔软，表面光滑，无灶性出血点（图1-A）。而模型组大鼠有大量的小米大小的灰白色结节凸出于肺表面，并且表面粗糙，质地变硬，可见点状、灶状出血，双肺明显肿胀。与模型组相比，所有白茶处理组和EGCG处理组的肺组织肿胀减轻，呈淡粉色，虽然可见不同程度的点状出血以及小米大小的凸出于肺表面的结节，但出血点和表面结节变小、减少，呈现比正常组弹性降低（图1-B—F）。

2.1.2 大鼠各处理组肺组织重量及肺指数

不同处理组间大鼠肺指数结果显示（表1），与模型组比，白茶提取物处理组和EGCG组肺指数均有所降低，尤其白毫银针提取物组与模型组存在显著性差异（＜0.05），但白牡丹提取物及EGCG处理组均无显著性差异。与正常组比，模型组及各白茶提取物处理组、EGCG组均明显增加，且具有显著性差异（＜0.05）。说明白茶提取物和EGCG对肺损伤具有恢复的作用。

2.1.3 肺组织HE染色后显微镜观察结果

大鼠肺组织HE染色结果显示（图2），蓝色为细胞核，红色为细胞质。正常组大鼠的肺泡形态结构完整，肺泡间隔清晰，未见明显炎性细胞浸润及纤维渗出等异常病变。模型组病变明显，肺泡形态结构大部分破坏，肺泡间隔增宽，肺泡壁明显增厚，肺泡腔变薄，表现为不同大小的巨噬细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生，部分形成圆形或不规则小结节，大量胶原纤维渗出。白茶提取物处理组间有所差异，白毫银针提取物处理组HE染色结果基本接近于正常组水平，效果最好；白牡丹提取物高剂量、低剂量组和EGCG组的肺组织结构虽然没有完全恢复到正常组水平，但比模型组肺组织损伤有明显减轻，肺泡结构损伤得到一定程度恢复。

注：A：NC组，B：MC组，C：BHYZ组，D：HBMD组，E：LBMD组，F：EGCG组

表1 白茶提取物对纳米SiO2诱导的大鼠肺指数的影响

注：同列数据后的不同小写字母表示在＜0.05水平差异有统计学意义。下同

Note: The values within a column followed by different lowercase letters show statistically significant differences at the 0.05 probability level. The same as follow

注：A：NC组，B：MC组，C：BHYZ组，D：HBMD组，E：LBMD组，F：EGCG组

2.1.4 肺纤维化半定量Ashcroft评分比较

如表2所示，与正常组相比，模型组、白茶提取物处理组、EGCG组的Ashcroft评分值均升高，且具有显著性差异（＜0.05），尤其模型组的评分显著升高，表示建立肺纤维化大鼠模型十分成功；与模型组相比，白茶提取物处理组、EGCG组的Ashcroft评分值均降低，且有显著性差异，其中白毫银针提取物的评分值最低，最接近正常组，显著优于白牡丹提取物高剂量组和白牡丹提取物低剂量、EGCG组，白牡丹提取物低剂量组与EGCG组间无显著性差异（表2）。

2.2 对纳米SiO2诱导的大鼠肺病理学的影响

2.2.1 对纳米SiO2诱导的大鼠肺组织氧化应激的影响

大鼠造模后，模型组大鼠较正常组的肺组织羟脯氨酸含量显著增高（<0.05）（表3），各白茶提取物组大鼠肺组织羟脯氨酸含量与模型组比较均有显著差异（<0.05），尤其白毫银针提取物组达到了正常组的水平，其余的白茶处理组虽然未达到正常组的水平，但与模型组相比，羟脯氨酸含量均有显著降低（<0.05）。

表2 各处理组大鼠肺纤维化的Ashcroft评分

表3 白茶提取物对纤维化大鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响

2.2.2 对纳米SiO2诱导的大鼠肺组织氧化应激的影响

大鼠各组肺匀浆液中NO、SOD、MDA、GSH-Px的指标分析结果如表4所示。与正常组相比，模型组在纳米SiO2刺激后肺组织NO含量明显升高，GSH-Px活力明显下降，差异均达到显著水平（<0.05）；与正常组比较，模型组肺组织中SOD、MDA表达水平分别略有降低和略有提高，但结果无显著差异（>0.05）；与模型组相比，白茶提取物处理组大鼠肺组织中NO、GSH-Px水平均有显著差异（<0.05），SOD和MDA水平与模型组相比，具有轻微的变化，未有显著差异（>0.05）；EGCG和白茶提取物灌胃大鼠后，其肺组织NO含量极显著降低，且低于正常组，其中白牡丹提取物高剂量组的效果最佳；所有白茶提取物处理组大鼠肺组织GSH-Px活力均有增加效果，白牡丹提取物和EGCG对GSH-Px活力促进作用较强，高于正常组水平，其中高剂量白牡丹提取物的作用最强；从各药物组大鼠肺组织SOD、MDA水平与正常组有轻微的变化，其水平无显著差异（>0.05）。

2.2.3 对纳米SiO2诱导的大鼠炎症因子的影响

如表5所示，模型组肺组织的炎症因子IL-6浓度显著高于正常组（<0.05），白茶提取物处理后肺组织的IL-6浓度均有不同程度下降，白毫银针提取物组肺组织IL-6的浓度虽然未达到正常组水平，但是与模型组相比具有显著性差异（<0.05），白牡丹提取物高剂量组、白牡丹提取物低剂量组和EGCG组都达到正常组的水平。上述结果清楚说明，白茶提取物处理纳米SiO2诱导的大鼠，对肺组织炎症有显著抑制作用，可以降低肺纤维化水平。

3 讨论

纳米SiO2是主要无机纳米颗粒材料之一，其粒径小，除了药物摄入人体外，还可以悬浮在空气中，颗粒被吸入肺组织和其他组织中将会导致机体组织损伤。纳米SiO2进入肺组织将会导致肺泡巨噬细胞和中性粒细胞释放多种活性氧物质，致使细胞内的活性物质水平提高，超过细胞内抗氧化物质的清除能力，因而，导致肺组织的损伤[8]。

肺成纤维细胞是肺内胶原的主要合成细胞，胶原纤维是肺纤维化的基础，而羟脯氨酸为胶原纤维化所特有，占胶原蛋白成分的13%。因此，通过测定羟脯氨酸含量可以间接反映胶原含量，可作为衡量胶原代谢的重要指标，用来分析肺纤维化的程度[9]。本试验结果显示，模型组的肺组织中的羟脯氨酸含量明显高于正常对照组，白茶提取物处理组肺组织羟脯氨酸含量明显降低，表明白茶提取物可以抑制纳米SiO2诱导的肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨素含量。

表4 白茶提取物对纤维化大鼠肺组织抗氧化能力的影响

表5 白茶提取物对大鼠肺组织炎症因子IL-6浓度的影响

GSH-Px、SOD等抗氧化酶组成了机体抗氧化防御系统[9]。一旦机体氧化损伤和抗氧化损伤失衡，就会引起炎症、细胞毒性、代谢异常及免疫功能降低，发生生物膜脂质过氧化反应，造成大面积细胞损伤导致组织器官纤维化。MDA是主要细胞膜脂质过氧化反应的终产物，在脂质过氧化作用下产生，具有细胞毒性。因此，测定机体组织中的MDA指标变化，可以有效地预测纤维化程度和发病趋势。本研究结果显示，经过纳米SiO2造模后，大鼠肺组织中SOD、GSH-Px活力显著降低，MDA含量增加，因为SiO2直接引发产生大量的自由基，导致氧化应激反应，也说明本试验成功建立肺纤维化模型。该模型中给予两周的白茶提取物后，对大鼠肺组织起到了不同程度的抗氧化作用，不仅提高了抗氧化酶SOD、GSH-Px的活力，而且降低了纤维化时升高的MDA浓度，减少细胞毒性，证实白茶具有一定的阻止肺纤维化的进程。

NO是一种多功能的生物介质，具有细胞毒性作用，可视为氧化指标之一，肺组织的各种细胞都具有生成NO的功能，其代谢紊乱会促进肺纤维化的发生发展。本试验结果发现，在纳米SiO2所致大鼠肺纤维化中NO含量均显著高于对照组，即NO代谢紊乱促进了肺纤维化的发生发展，与文献报道结果相似[10-11]。并且白茶提取物对肺纤维化具有很好的抗氧化效果，达到正常大鼠水平甚至优于正常大鼠水平，说明白茶提取物具有清除纳米SiO2产生的NO自由基能力。

纳米SiO2引起的肺纤维化不仅有氧化应激作用，也导致炎症反应。本研究通过测定炎症因子IL-6水平，发现白茶对纳米SiO2引起炎症起到抑制作用。IL-6是一种具有广泛生物学活性的多肽类物质，可作用于多种靶细胞而参与免疫和炎症过程。经IL-6抗体对大鼠过敏性肺炎的纤维化抑制作用试验证明，IL-6具有致炎致纤维化的作用，因而，认为IL-6在肺部炎症及肺纤维化的发生发展过程中也发挥着一定的作用[12]。本研究结果表明，白茶提取物可以显著降低因纳米SiO2所致的肺组织IL-6水平，推测白茶提取物不仅可以通过抗氧化作用抑制肺纤维化，而且能通过抗炎作用或者抗炎抗氧化协同作用修复和延缓肺纤维化的病情。

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The Inhibitory Role and Mechanism of White Tea Extracts on Pulmonary Fibrosis Induced by Nano-sized SiO2in Rats

PARK Soomi1, KIM Eunhye1, CHEN Xinghua2, WANG Qianchao3, HE Puming1*, TU Youying1*

1. Department of Tea Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. Organization Group of Fuding Tea Industry Development, Fuding 355200, China; 3. Fuding Tea Industry Bureau, Fuding 355200, China

Fifty-four Wistar rats were randomly divided into six groups: control group, model group, white silver needle extract group, high and low dose white peony extracts and EGCG group, with 9 rats in each group. The other five groups except the control group were treated with nano-sized SiO2dust (80 mg·mL-1) by non-exposed endotracheal intubation. After two weeks of intragastric administration, the contents of hydroxyproline(HYP), nitric oxide (NO), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), glutathione peroxidase (GSH-Px) and the morphological changes of lung tissues were detected. The results show that compared with the model group, the pathological changes of each white tea extract treatment group and EGCG group were alleviated in varying degrees, and the effect of white silver needle extract group was the best. The content of NO and inflammatory factor IL-6 in lung of rats treated with white tea extract and EGCG were significantly lower than those of model group (<0.05), GSH-Px activity was higher than that of model group (<0.05). High-dose white peony extract group had the best effect on reducing NO content and increasing GSH-Px activity. This study shows that white tea extract had a significant effect on oxidative stress injury of lung fibrosis induced by nano-sized SiO2in rats. The slow and repairing effects are mainly related to the antioxidant effect and the inhibition of inflammatory reaction.

white tea extract, nano-sized SiO2, wistar albino rat, pulmonary fibrosis, inhibition, recovery

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2020)02-157-08

2019-02-28

2019-05-24

2016福鼎市政府项目（KH20170151）

朴秀美，女，博士研究生，主要从事食品功能性成分的研究。*通信作者：pmhe@zju.edu.cn，youytu@zju.edu.cn

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