高效液相色谱法测定我国北方红枣中环磷酸腺苷的含量

2020-04-20 11:14李建贵董树清孙振荣邱洪灯
分析测试技术与仪器 2020年1期
关键词:腺苷磷酸红枣

李 辉,赵 亮,李建贵,张 磊 ,董树清,孙振荣,邱洪灯

(1.中国科学院 兰州化学物理研究所,甘肃 兰州 730000;2.新疆农业大学,新疆 乌鲁木齐 830052;3.新疆红果果农林科技有限公司,新疆 乌鲁木齐 830052)

环磷酸腺苷(cyclic Adenosine-3,5-Mono Phosphate,cAMP),是核苷酸的衍生物[1],分子式C10H12N5O6P.1980年Cyong等[2]首次发现红枣含有动物体内存在的环磷酸腺苷.作为“第二信使”的环磷酸腺苷是有机体中广泛存在的一种重要的生理活性物质,参与多种生理生化过程的调节.现代医学证明外源性环磷酸腺苷具有改善心肌缺氧、扩张冠脉、增强心肌收缩力、增加心排血量等作用,可用于心绞痛、急性心肌梗死的辅助治疗[3-4].世界各国研究人员对cAMP进行了大量的研究, 结果表明cAMP在很多领域具有重要作用[5-6].

据文献报道,红枣中含有多种丰富的化学物质, 如含多糖、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、有机酸和多种微量元素[7-9].同时,红枣中cAMP的含量也是已知植物中最高的,是向日葵、烟草、大米、松树、生菜等其他植物的1 000倍甚至数万倍左右[10-12].cAMP也是红枣中最重要的生物活性物质之一, 但是不同品种的红枣,其含量差异较大.随着红枣综合利用和农业产业化的发展以及医疗和保健行业对cAMP 的需求,从红枣中提取cAMP受到了越来越多的关注[13].高效液相色谱(HPLC)因高效的分离能力被认为是最有效的分离技术之一[14].因此,采用HPLC法测定红枣中cAMP的含量的比较准确有效,具有开发价值[15-17].目前,虽然已有对红枣中环磷酸腺苷的成分结构及含量的报道[18-19],但对我国红枣主产地北方地区,不同区域不同品种红枣中cAMP含量的测定和比较工作未见报道.

因此,本文以我国北方不同产地不同品种16种红枣为研究对象,应用HPLC法测定其cAMP含量并对不同地区不同品种作比较.该方法提取工艺简单,数据准确可靠,可以为我国北方地区红枣深加工品种筛选提供参考依据,有助于红枣高值化利用和推动地方经济发展.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:高效液相色谱仪(包含Waters 515HPLC Pump , Waters 996二极管阵列检测器, N-3000 双通道色谱工作站);超声波振荡器(KQ5200型);DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器;调温型电热套(MH-5000型);旋转蒸发仪(RE-52C型);电热鼓风干燥箱;台式高速离心机(TG16-WS型);电子秤(FA1004型).

试剂:红枣样品为市售,产地分别来自甘肃、新疆、宁夏、山东,陕西、辽宁等地.甲醇(色谱纯,山东禹王和天下新材料有限公司),冰醋酸(利安隆博华(天津)医药化学公司),环磷酸腺苷标准品(纯度99.5%),工业乙醇,去离子水(Molresearch 1010a 10L/H型).

1.2 试验方法

1.2.1 方法与结果

红枣中cAMP含量的测定方法:将各种红枣样品烘干、粉碎,在最优条件下进行提取,以提取液中cAMP的质量和红枣干粉质量之比作cAMP含量测定指标进行[3].

(1)

1.2.2 波长选择

对cAMP标准品水溶液进行紫外扫描, 结果如图1所示.由图1可见,cAMP 在波长210、254 nm 处吸收最大, 因为在210 nm 以下溶解时,氧有吸收, 干扰较大, 故检测波长选用254 nm.

1.2.3 色谱条件及标准曲线绘制

色谱柱为Hibar ODS-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)柱, 流动相为甲醇: 2%醋酸(体积比为5∶95), 流速 0.5 mL/min,检测器为Waters 996,检测温度为25 ℃,检测波长为254 nm, cAMP标准品色谱图如图2所示.标准曲线如下:精密称取cAMP标准品5.0 mg于50 mL容量瓶中,加入蒸馏水溶解并定容至刻度线,摇匀得0.1 mg /mL储备液.

称取50 mg环磷酸腺苷标品,溶于50 ml水配成1.0 mg/mL环磷酸腺苷标准溶液,之后分别配置成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mg/mL系列标准溶液,进行液相色谱检测并绘制标准曲线(如图3所示),得到回归方程为:Y=8.260 8×107C-261 530.2,R2为0.998 2.表明cAMP在 0.1~1.0 mg/mL范围内,峰面积与浓度的线性关系良好.

图3 cAMP标准曲线图

1.2.4 样品处理及检测

分别将不同产地的16种红枣切片,40 ℃干燥48 h,粉碎机磨成粉状.准确称取各种红枣粉100 g,800 mL 80%乙醇溶液加热煮沸提取2 h,过滤得到提取液,然后再加入800 mL 80%乙醇溶液加热煮沸提取2 h,过滤得到提取液,所得上清液合并浓缩,以 8 000 r/min离心15 min,取上清液用蒸馏水定容至100 mL刻度处.过 0.22 μm微孔滤膜,用高效液相色谱法进行测定.

1.2.5 环磷酸腺苷提取单因素试验

选择料液比、提取时间、提取温度、提取次数和不同乙醇质量分数5个因素进行单因素试验,以环磷酸腺苷含量作为环磷酸腺苷提取效果的评价指标.

(1)料液比对cAMP提取率影响:以新疆骏枣为试验材料,在加热提取2 h,乙醇质量分数80%的条件下,选取1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 这5个料液比水平研究对 cAMP 提取率的影响,结果如图4所示.由图4可知,随着料液比的增加,提取液中cAMP的含量增加,1∶8之后提取率增加幅度不太明显.因此可选用于料液比为1∶8对红枣中环磷酸腺苷进行提取.

图4 料液比对 cAMP 提取率的影响

(2)提取时间对cAMP提取率影响:在料液比1∶8、乙醇质量分数80% 的条件下,选择0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 5个加热提取时间研究对cAMP提取率的影响,结果如图5所示.由图5可知,随着超声时间的延长,提取率增加,在2 h时达到最大值,之后随时间的延长提取率降低,可能是加热提取时间过长,细胞中其他物质溶出,影响cAMP的提取.因此可选用加热提取时间为2 h对红枣中环磷酸腺苷进行提取.

图5 提取时间对 cAMP 提取率的影响

(3)提取温度对cAMP提取率影响:在料液比1∶8、加热提取时间2 h、乙醇质量分数80%的条件下,选取20、40、60、80、100 ℃ 5个提取温度,研究对 cAMP 提取率的影响,结果如图6所示.由图6可以看出,随着加热温度的升高,cAMP的含量也逐渐增大.温度超过80 ℃,达到100 ℃ 煮沸提取时,红枣细胞壁破碎煮烂以后随着其他可溶性成分增加,cAMP提取率降低且煮烂后续分离难度随之增加,因此选择以80 ℃为最佳的环磷酸腺苷提取温度.

图6 温度对 cAMP 提取率的影响

(4)提取次数对cAMP提取率影响:在料液比1∶8、加热提取时间2 h、乙醇质量分数80%、加热温度为80 ℃的条件下,进行4次提取,研究对 cAMP 提取率的影响,结果如图7所示.由图7可以看出,随着提取次数的增加,cAMP的含量先逐渐增大后减小.因为随着提取次数的增加,cAMP的含量随之减少,红枣中其他可溶性部分继续溶出,影响对cAMP提取,考虑到能源损耗以及cAMP含量的影响选择提取次数为2次.

图7 提取次数对 cAMP 提取率的影响

(5)不同乙醇浓度对cAMP提取率影响:在料液比1∶8、加热提取时间2 h、2次提取、加热温度为80 ℃条件下,选取乙醇质量分数为10%、20%、40%、60% 和80%,研究5个不同浓度梯度对 cAMP 提取率的影响,结果如图8所示.由图8可以看出,随着提取次数的增加,cAMP的含量先逐渐增大后减小.因为在纯乙醇提取时环磷酸腺苷溶解性降低且其他脂溶性溶解质溶出,cAMP的含量随之减少,影响对cAMP提取,因此选择最佳乙醇提取质量分数为80%.

图8 不同乙醇质量分数对 cAMP 提取率的影响

2 结果与讨论

2.1 精密度

取质量浓度为0.5 mg/mL的cAMP标准液20 μL,自动进样,采用HPLC测定其cAMP 含量.平行测定6次,计算平均值和相对标准偏差(RSD)为0.63%,结果如表1所列,表明该法精密度良好.

表1 精密度试验

2.2 重现性

同一批次样品溶液6份, 分别按照上述色谱条件测定, 以峰面积与浓度的比值计算, 得到cAMP的RSD为1.6%,结果如表2所列.

表2 重现性试验

2.3 回收率

取已知含量的新疆骏枣样品溶液 6 份各10 mL, 精密加入等量cAMP标准品, 分别吸取1.0 mL定容到10 mL量瓶中, 经0.22 μm滤膜过滤后, 进样检测.测得平均回收率为102.1%,结果如表3所列.

2.4 我国北方16种红枣中环磷酸腺苷(cAMP)含量的测定比较

采用高效液相色谱测定16种红枣中的cAMP的含量,其中新疆骏枣的液相色谱图如图9所示,另外我国北方16种枣中cAMP的含量如表4所列.

表3 回收率试验

图9 新疆骏枣中cAMP 含量测定

表4 北方16种红枣中cAMP含量

3 结论

采用HPLC 法分析红枣中含量极微的 cAMP,准确度高,精确度好.通过研究新疆骏枣及我国北方地区共16种红枣的cAMP含量,建立了HPLC法分析红枣中cAMP 含量方案.在供试样品中,测得新疆骏枣cAMP 的质量分数最高(372 μg/g),并对我国北方16种红枣的cAMP 含量进行比较,发现新疆红枣具有种类丰富且cAMP含量高的特点,非常有利于cAMP的开发利用.该方法操作简便灵敏度高、准确性和重现性好, 可作为大枣的质量控制方法,且对红枣进行深加工、带动当地经济起到积极的作用.

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