关于红霉素药物残留检测的研究概况

张晓云，李培锋*，孙华，毛伟，白玉廷，何秀玲

1. 内蒙古农业大学兽医学院（呼和浩特 010018）；2. 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室（呼和浩特 010018）

红霉素因其具有较高的抗革兰氏阳性菌活性作用和低毒性的特点，成为在此类化合物中首个广泛应用在临床上的药物，和其他大环内酯类抗生素相比较有性质相似或更强的抗菌活性[1-2]。红霉素在最开始是作为青霉素的替代品在临床兽药应用方面应用广泛，目前红霉素已被广泛应用于畜禽细菌性和革兰氏阳性菌感染的化学治疗，特别是在低剂量下红霉素有良好的促生长作用，亦成为重要的饲料添加剂来提高饲料转换率。虽然红霉素有良好的药理作用，但长期代谢不良会淤积一定浓度在身体内，药物残留问题则对机体产生一些副作用，主要危害是引起人体的内分泌紊乱、水电解质及糖代谢异常、性早熟、致癌、致畸；红霉素酯化物易发生，发生率高达40%，肝功能不良者禁用。同时可引起人体的过敏反应，导致人体的正常菌群失调，使致病菌产生耐药性，诱发癌症等。此外它会影响人体正常的激素水平，并使儿童异性化倾向、肿瘤等，使人出现诸多不适症状。

1 红霉素残留检测情况的研究进展

目前国内外主要的检测红霉素的方法和技术包括：（一）能够同时进行分离、分析，具有高效分离技术和高检测灵敏度，对红霉素残留情况进行定性、定量分析的理化分析法，如（1）高效液相色谱法（HPLC），根据检测器的不同又分为液相色谱-紫外法（LC-UV）、液相色谱-荧光法（LC-FLD）、液相色谱-蒸发光散射检测法（LC-ELSD）、液相色谱-电化学法（HPLC-ECD）、液相色谱-二极管阵列检测法（LC-DAD）、液相色谱-喷雾法（LCCAD）；（2）气/质联用法（GC-MS）；（3）液/质联用法（LC-MS、LC-MS/MS）；（4）薄层色谱法（TLC）；（5）分子印迹固相萃取-高效液相色谱法（MISPE-HPLC）；（二）免疫分析法，如酶联免疫分析法（ELISA）、荧光微球免疫层析法（FMCA）、胶体金免疫层析法（IGCA）；（三）生物测定法，主要有微生物检测法等[3]。

1.1 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法因其具有分离速度快、检测灵敏度高、自动化程度高等众多优点，成为至今广为使用的一种理化检测方法，它能做到精确定性及定量检测食品中的有毒及有害残留物。因红霉素仅在210 nm处呈现一定的紫外线（Ultravioletray，UV）吸收，许多内源性杂质会在210 nm处产生强烈干扰，所以通常情况下不采用紫外检测器，大量的文献表明测定红霉素残留大多选用HPLC-ECD（电化学检测器）或柱前衍生化HPLC-FLD（荧光检测器）。于慧娟等[4]建立了高效液相色谱-荧光法对虾组织中红霉素残留量的检测，检出限为150 μg/kg，回收率≥75%。惠芸华等[5]建立了以高效液相色谱法测定罗非鱼中红霉素残留量的方法，提出了以乙腈为提取剂，经过液-液萃取、固相萃取、反萃取等步骤对样品进行分离净化的样品处理方法，方法检出限为400 μg/kg。Edder等[6]采用HPLC-FLD测定肉、鱼、肝、肾、蛋和奶中红霉素的定量分析，采用罗红霉素为内标，该方法在5～50 μg/mL范围内线性关系良好。

1.2 气质联用法（GC-MS）

气相色谱-质谱联用检测法实现了高效层析分离和检测联机，可用微电脑控制层析条件、程序和数据处理，其特异性、灵敏度和重复性均较好，可以一次性地完成同一物质中多类药物及其代谢物的检测。因大环内酯类药物的特性，如分子量大，且有多数的极性基团，导致其不可直接采用气相色谱检测，通常需要进行复杂的衍生化过程才可以进行GC-MS分析。Takatsuki等[7]建立了GC-MS法检测组织中红霉素残留的方法。前处理过程为：用甲醇提取肌肉样品，LLE后再经硅胶固相萃取柱净化，其目的是去除干扰性杂质，在铂催化下加氢，后中性糖链在HCl的作用下水解脱去，最终水解产物生成醋酸酯，其目的是为了用来提高检测的灵敏度。近几年，国外考古学家考古出土的有机残留物、有机胶料、有机涂层等的分析报道[8]，这些物质的检测应用最多的当属气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），该技术对文物、有机物的分析检测涉及的也较为全面。目前我国关于文物有机物的分析测定在气相色谱-质谱技术方面的报道很少出现。它可实现复杂文物体系中有机物的定性及定量测定。分析过程中取样量极少，检出限可达ng级别，在很大程度上避免了对文物的损坏，在文物有机分析中的地位不可撼动。气相色谱-质谱虽然优点颇多，但相对于大环内酯类药物的性质而言，对其样品前处理以及检测过程都尤为繁琐（包括一系列衍生化过程）。因此，检测结果的准确性取决于选取怎样高效的样品前处理方法及色谱分离条件。对于分析物的要求：（1）良好的热稳定性和挥发性，一般在250 ℃下可以气化；（2）不含无机盐、酸等对色谱固定相产生破坏或影响分析准确性的无机物。此外，使用通用型的氢火焰离子化检测器（FID）时，检测器无法辨认流出的组分，对复杂样品中的共流出峰缺乏指认和定量的手段。

1.3 液质联用法（LC-MS、LC-MS/MS）

因组织、水产品等样品中存在许多干扰性物质，高效液相色谱检测样品中红霉素的含量具有一定的局限性。而采用液质联用法，可以分析GC-MS所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定的化合物。其优点为：（1）应用广泛，对大部分的化合物几乎都适用，在很大程度上解决了分析热不稳定化合物的难题；（2）分离能力强，对于在色谱上没有完全分离开的化合物，只要通过MS的特征离子质量色谱图就可以区分各自的色谱图来进行定性定量；（3）定性分析结果可靠，可明确每一个组分的分子量和分子的结构信息；（4）检测限低，MS具备高灵敏度，即使在较低浓度的情况下也能够对样品进行很好的定性定量确认检测；（5）分析时间快，使用的液相色谱柱为窄径柱，大大减少了检测时间，提高了分离效果；（6）自动化程度高，LC-MS/MS具有高度的自动化。

因液质联用法的高灵敏度和高选择性，对于大环内酯类这样的高分子药物采用LC-MS法确证是较为理想的方法，Masakazu Horie等[9]采用LC-ESI-MS法测定肉类中的8种大环内酯类抗生素残留。Delepine等[10]研究了采用PB/LC/MS方法检测牛肌肉中5种大环内酯类抗生素的方法，其中采用梯度洗脱的反相液相色谱-MS检测法证明在牛肌肉中有红霉素、螺旋霉素、泰乐霉素、替米考星和交沙霉素的残留。

近年来LC-MS/MS联用技术日趋成熟，该法比LC-MS定性更可靠，定量更灵敏准确。Dubois等[11]采用LC-MS/MS法测定动物组织、牛奶和鸡蛋中的5种大环内酯类残留，其回收率达到80%～110%，相对标准偏差为2%～13%。于慧娟等[12]建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中红霉素残留量的方法，以红霉素同位素标记物为内标，检出限达1.0 μg/kg。张晓燕等[13]建立了高效液相色谱-串联质谱法测定蜂王浆中红霉素及其代谢物。于慧娟等[14]建立了高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中红霉素的残留，包括鱼、虾、蟹、甲鱼等水产品。周玲等[15]建立了高效液相色谱串联质谱检测巢脾中红霉素的残留，包括蜜蜂及蜂产品；林维宣等[16]采用液相色谱串联质谱法检测关于牛乳中多肽类抗生素的残留量。

1.4 薄层色谱法（TLC）

薄层色谱法主要应用于难挥发或高温下易变化而不适用于气相色谱的物质。它具有分离速度快、选择性好、显色容易的优点，不仅适用于微量样品（0.01 μg）的定性分析，也用于大量样品（大于500 mg）制备。按涂布薄层固定相的性质可分为吸附薄层色谱、表面分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和薄层电泳等。对于红霉素来说，茴香醛-硫酸试剂遇红霉素初期显蓝紫色，反应1 h后红霉素呈现橄榄绿色。韩南银等[17]建立了薄层色谱法检测蜂蜜中红霉素的残留，利用固相萃取原理对蜂蜜中红霉素进行提取，其检测限量达到5 mg/kg。因蜂蜜组成成分复杂，前处理比较麻烦，故采用薄层色谱法检测可以排除许多干扰因素，取得良好的检测结果。但缺点也较明显：①对于复杂化合物的识别能力不足，分离效果差，不能进行准确定量；②影响因素较多；③每一类药物都包括几种或十几种化学结构和性质非常相似的化合物，因药物含量甚微，对生物高分子的分离效果不甚理想，不如采用GC/MS和HPLC或LC-MS/MS灵敏；④对于红霉素来说达不到农业部规定的检测要求。

1.5 微生物检测法

微生物效价法是经典的抗生素含量测定法。王敏等[18]应用微生物生长抑制原理，通过Bacillus stearothermophilus（嗜热脂肪芽胞杆菌）细菌的生长与否，对大环内酯类药物残留进行定性检测；Markakis等[19]于1996年利用微生物法定量检测了动物饲料中红霉素的含量；一方面根据微生物自身特点的局限性，另一方面不同生产厂家生产出来的菌种、产品的组成组分也大不相同，导致检测结果有明显的差别，故用该方法很难达到准确的定性定量分析的目的。这种方法在分析时间、分析成本、对目标物质的分离和确认能力、方法的定量能力上都有着明显的不足，特别是在畜产品和食品中药物的残留分析领域中发挥的作用不大，因此主要用于大批样本中抗微生物药残留的快速筛选。随着抗生素类药物的发展和分析方法的进步，理化方法逐渐取代了生物学法。

1.6 酶联免疫分析法（ELISA）

酶联免疫分析法是基于抗原和抗体特异性反应而建立的，该方法有两个特点：一是抗原抗体免疫反应在固体表面进行，二是用酶作为标记物进行蛋白质测定。其中酶反应的催化效应起到放大反应效果的作用，从而提高ELISA检测技术的灵敏度。酶联免疫分析法已较多地应用于动物源性食品中各类抗生素残留的定性和定量测定，在水产品抗生素残留检测领域也有所应用。

崔廷婷等[20]建立了酶联免疫分析法测定猪肉、猪肝、牛肉、鱼肉、虾肉、蜂蜜和牛奶中红霉素的方法，其检测限分别为4.13，8.23，0.78，3.75，7.94，3.09和1.87 μg/L，样品添加回收率范围为69.0%～107.5%，批内变异系数为5.7%～11.4%，批间变异系数为8.7%～14.0%；与硫氰酸红霉素的交叉反应率为114%，与琥乙红霉素的交叉反应率为67.4%，与其他药物的交叉反应率均小于0.1%。Albrecht等[21-22]建立了牛奶中检测红霉素的ELISA方法。该方法中红霉素的LOD为10 ng/kg。韩青等[23]建立了牛奶中ERY的icELISA，检测限为0.3 μg/L。

1.7 分子印迹固相萃取-高效液相色谱法（MISPEHPLC）

分子印迹技术，又称分子烙印技术，是将模板分子（印迹分子、目标分子）与交联剂在聚合物单体溶液中进行聚合得到固体介质，然后通过物理或化学方法洗脱除去介质中的模板分子，得到“印迹”有目标分子空间结构和结合位点的分子印迹聚合物（MIPS）。它具有三方面的特点：①预定性，可以根据不同的目的制备出不同的分子印迹聚合物，以满足不同的需要；②识别性，分子印迹聚合物是根据模板分子定做的，可专一地识别印迹分子；③实用性，可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗体与抗原相比拟，但由于它是由化学合成的方法制备的，因此又有抗恶劣环境的能力。基于这些特点，目前该方法已在如下方面得到了应用：色谱分析、固相萃取、仿生传感器和模拟酶催化。宋彬等[24]建立了一种分子印迹固相萃取-高效液相色谱测定猪肉中红霉素的方法，其残留检出限（S/N=3）为0.2 mg/kg。猪肉样品中不同添加水平下红霉素的加标回收率为95.2%～104.2%，相对标准偏差（RSD）小于5%。胡琪等[25]采用沉淀聚合法制备红霉素分子印迹聚合物，考察了不同分散相对分子印迹聚合物制备及其对吸附性能的影响，并通过Scatchard模型进一步评价了聚合物的吸附特性，探究了红霉素分子印迹聚合物在其结构类似物及实际食品样品中常见抗生素的吸附特异性，并对牛奶和鸡蛋样品进行了加标回收试验。实际样品中的平均回收率为82.99%～98.09%。

1.8 荧光微球免疫层析法（FMCA）

FMCA的原理是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测限（包被抗体或包被抗原）和质控线（抗抗体）的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。荧光微球FMs，它是一种新型的载体材料，主要是有机或无机聚合物材料，内部含有荧光物质，外部能量刺激后会发出荧光，作为特殊功能微球，形态稳定，粒径均匀。它作为一种抗体标记示踪物，通过与抗体偶联，比较试纸条荧光显色强度、跑样背景，微球标记抗体释放情况及检测灵敏度，来选择最佳颜色特征的微球。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原红霉素来说，待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以，红霉素多采用竞争免疫层析法检测。Li等[26]报道了红霉素的荧光微球免疫层析（FMCA）测定法，选择与红霉素结构相关的Abs为抗ERY单克隆抗体（mAb），抗原（Ag）为ERY-BSA，采用竞争免疫层析法检测。结果表明，红霉素在原料奶中的检出限（LOD）为0.13 ng/mL，回收率为91.8%～109.2%，变异系数（CV）为5.4%；李向梅[27]建立了可同时检测牛奶中红霉素的多残留荧光微球定性和定量免疫层析方法。该方法牛奶中红霉素的cutoff值为2.5 μg/L。牛奶样本简单稀释，同步检测红霉素的时间在20 min以内。通过荧光信号读数仪分析，该方法对牛奶中红霉素的检测限为0.13 μg/L。红霉素在1.25～5 μ g/L的添加水平下回收率为91.8%～109.2%，变异系数为5.4%～11.3%。但荧光微球合成的技术难度相对较大，目前国内制备的荧光微球存在粒径不均一等现象，主要以进口为主，价格相对昂贵，荧光微球免疫试纸条在光照射、温度、碰撞、湿度大等外界条件下容易发生荧光淬灭现象。且受基质干扰影响较大。

1.9 胶体金免疫层析法（GICA）

GICA的原理是结合了胶体金技术和免层析技术发展而来的，其本质是一种固相反应的ELISA，并用胶体金来代替底物显色。是以胶体金作为示踪标记物，利用抗原抗体在固相载体反应的新型免疫标记技术。实际上是蛋白等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理目前还未定论，一般认为是金颗粒表面的负电荷和蛋白质的正电荷静电吸附，从而形成牢固的结合。其优点是检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需要仪器设备，操作人员不需要特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染；单一试剂，一步操作，小型实验室即有条件开发生产，干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。有研究报道[27]胶体金试纸条检测牛奶中红霉素的cut-off值为5 μg/L，检测在10 min内完成。是一种定性或半定量的检测方法，用于不需要精确定量检测，但需快速得出检测结果的分析。

免疫分析技术与常规的理化分析技术对比而言最大的优点在于易操作、分析速度快、检测成本低。以微量滴定板的ELISA例子中看出，免疫测定法以取样量小，前处理简单，容量大，仪器化程度低，分析效率是HPLC或GC的几十倍以上。免疫测定法的缺点在于确定待测物组成或结构方面的信息太少（仅为吸收度或计数），一般不具备多残留分析能力；因其分析过程繁琐，试验操作过程中影响结果的因素太多，将其作为标准化方法难以实现；且研究试验方法周期长，某些待测物的半抗原合成成本过高。故只能作为其重要补充。

1.10 固相微萃取SPME

固相微萃取（Solid Phase Micro-extraction，SPME）是一种适用于气体和液体样品的新颖的样品前处理技术。主要包括两个过程：（1）将涂有固定相的萃取头插入样品中，待测物将在固定相涂层与样品中进行分配直至平衡；（2）将萃取头插入分析仪器的注射口，当待测物脱附以后，可进行分离和定量检测。巧妙地将待测物的萃取、脱附、进样结合在了一起。而顶空固相微萃取是SPME分析方法中最推荐的一种方法，其中固相微萃取的装置类似于注射器，在萃取头部分有MCM-41复合介孔分子筛作为固相微萃取涂层，微萃取涂层是SPME的主要部分，在多相平衡的基础上，依据分析物在萃取头上与试样之间的分配平衡而实现待测物的检测。但由于其萃取涂层容易磨损，导致萃取涂层的使用寿命有限。SPME发展至今，已被广泛应用到环境监测、食品检验等领域。徐娜[28]研究了一种固相微萃取检测污水处理厂中大环内酯类抗生素的残留方法，其中包括红霉素、阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等。其中红霉素的方法检出限是0.8～3.2 ng/L，回收率为99.1%～112.4%。

由于红霉素仅在210 nm呈现紫外吸收，故紫外检测器不能满足残留检测要求，常采用荧光检测器对其进行含量检测，需经过柱前衍生，因FMOC-CL同羟基反应生成荧光酯，因而具有荧光性。红霉素的衍生就是利用分子中的羟基同FMOC-CL反应生成荧光衍生物的性质来实现的，目前采用HPLC存在的问题是：①在有样品基质的情况下目标峰有干扰峰的出现，衍生产物和副产物分不开，响应值整体偏低；②衍生产物存在时间太短，12 h后就会分解，样品基质对衍生的影响较大，目标峰峰形较差；样品前处理一般包括提取、净化、浓缩、衍生四部分，前处理步骤越复杂，其干扰因素就越多，衍生产物就越不稳定，产生的误差就越大，导致灵敏度降低，回收率低。

荧光微球免疫层析法和胶体金免疫层析法中荧光微球的合成、胶体金的制备难度较大，红霉素药物抗原抗体的制备过程较难，且定量不准确。

2 结语

动物性组织中药物残留问题引发的严重后果已向人类敲响了警钟。大规模发展生态农业、生产绿色食品（肉、蛋、奶、鱼、虾）是我国畜牧业发展的最终目标。人们之所以对药物残留问题如此关注，归根结底是我国对动物源性食品药物常规检测认识的匮乏、许多生产者不重视药物残留问题且不了解应如何控制药物残留。动物性食品的安全关系到兽药生产者、广大消费者、畜牧部门、畜禽饲养者及农业等，其中兽药生产者和畜禽饲养者是最重要的，他们只要能从思想根源处认识到兽药残留带来的危害，能够安全生产动物性食品，合理用药，选用合适的剂量疗程，合理的轮换用药，从根源上拒绝药物残留，这样我们才能吃到最安全的食品，才能有效控制或避免兽药残留对人类健康的影响。随着经济飞速发展、人民生活水平的不断提高，对动物性食品的需求量也在不断增加，动物性食品兽药残留问题也逐渐成为全社会广泛认同的公共卫生问题。兽药残留问题的危害不言而喻，对于人类身体康健、养殖业的健康发展乃至最终步入国际市场的影响都是及其严重的。故应加强兽药监管方面的工作力度，将用药规范做到最合理化，将药物残留对人的危害降到最低，避免我国在国际市场的竞争力受到影响。