酸碱滴定法解决绵羊冻精稀释液卵黄沉淀试验

肖广庆，李新月，刘欣伟

（1.洛阳市畜牧良种繁育推广中心，河南 洛阳471013；2.河南科技大学）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 器材

采精器材（假阴道、水浴锅、集精杯、保定架），精液检测（显微镜、密度仪、水浴锅），酸碱滴定（酸度仪、定量滴定管、定量瓶），冻精生产（细管灌装机、冷冻仪、冰箱、冰柜）。

1.1.2 种羊

洛阳市畜牧良种繁育推广中心种羊场肉用种公羊。

1.1.3 稀释液

羊冻精稀释液配方主要成分：三羟甲基氨基甲烷、糖类、柠檬酸钠、柠檬酸、卵黄、甘油、抗生素。经测基础液pH值为6.42，稀释液pH值为6.45。

1.1.4 标准pH值溶液

氢氧化钠（pH值为13）。

1.2 试验方法

先用氢氧化钠溶液滴定10 ml 基础液，滴定时记录每次滴定量（用0.2 ml滴定管或移液枪），滴定后摇匀用酸度仪测量pH，测3 次记录平均值，直至较理想pH 值（6.6～6.9），计算滴定量，超过2 ml，则用较高浓度氢氧化钠溶液替代，换算滴定量直接滴定。调好pH值后的基础液加甘油、卵黄配制成品稀释液，安排采精、冷冻，观察活力情况，并与滴定前配方稀释液进行对比。

1.3 pH值测定

酸度仪使用前要用标准液校准，误差在规定范围方可测定。测定时待测液最好放水浴锅中，水浴锅温度与室温一致，在酸度计允许范围即可，记录时3 次测定取平均值。具体滴定情况见表1：

表1 10 ml基础液用标准氢氧化钠液滴定情况

由表1 可知：10 ml 基础液滴定0.1 ml NaOH 溶液pH值为6.83，为较理想中性偏酸环境。配制100 ml基础液可用1 ml NaOH溶液校准。

1.4 试验组与对照组稀释液配制

试验组稀释液用滴定后基础液（100 ml 原基础液加1 ml NaOH）加卵黄、甘油配制。对照组用滴定前基础液加卵黄、甘油配制。配好后放冰箱（0～4 ℃）保存。

2 结果与分析

2.1 冰箱存放一晚稀释液情况

试验组卵黄沉淀较少，对照组出现大量卵黄沉淀，沉淀均为乳白色颗粒沉淀。摇匀后镜检试验组卵黄滴布满视野，对照组有少量卵黄滴但不影响视野清晰度。

2.2 羊精液稀释、平衡、冷冻后活力情况（表2）

表2 羊精液稀释、平衡、冷冻后活力情况

羊鲜精用两种稀释液稀释后放0～4 ℃冰柜平衡4 h、用细管灌装冷冻后观察活力情况。

由表2 可知：对照组平衡后活力高于试验组，冷冻后却低于对照组。说明，酸碱滴定虽然可以改变卵黄沉淀，但精子活力下降，并且在显微镜下放置10 多分钟后出现大量聚集死亡现象。［1-2］

3 讨论

羊冻精稀释液pH 值是导致卵黄沉淀的因素之一，但调整pH值后仍有少量沉淀，说明导致卵黄沉淀的因素除基础液pH值外还有其他因素存在。

单纯用酸碱滴定方法调整基础液pH值可能改变稀释液电离平衡，导致精子产生凝聚反应而大量死亡。

稀释液中加有三羟甲基氨基甲烷等缓冲物质，酸碱滴定降低稀释液的缓冲性，导致精子冻伤或死亡，降低冻后活力。如果改用三羟甲基氨基甲烷滴定校准基础液酸碱度可能更为合适。