宁夏不同地区盐碱化土壤细菌群落多样性分布特征及其影响因子

李 明,毕江涛,王 静

1 宁夏大学葡萄酒学院,银川 750021 2 宁夏大学葡萄与葡萄酒研究院,银川 750021 3 宁夏大学葡萄与葡萄酒教育部工程研究中心,银川 750021 4 宁夏大学环境工程研究院,银川 750021

生物多样性与生态系统功能间的关系是当今生命科学领域的研究热点问题之一。其中,土壤是陆生植物所依赖的复杂生态系统,土壤微生物则是土壤生态系统中极其重要的部分,在土壤养分循环、系统稳定性、抗干扰能力以及可持续利用等方面占据主导地位。从农业生产的角度考虑,探索土壤微生物多样性,群落结构、种类组成及其时空分布特征,有助于阐明生物多样性与生态系统功能之间的关系,进而阐释土壤生态系统的功能与稳定性即土壤回复力和抗性之间的关系[1],这对于保障土壤质量和健康以及生态系统的可持续发展具有重要的理论和实践意义。

宁夏银川平原地处中温带半干旱、干旱区,降水稀少,蒸发强烈,宁夏水资源总量为11.7亿m3,仅占全国水资源总量的0.04%。环境因素以及人类活动的强烈影响,造成了生态环境恶化,土壤盐碱化就是当地农业生产最大的限制因子[2]。因此阐明宁夏不同地区盐碱地的盐碱现状和可溶性盐基离子组成对于开垦盐碱荒地,提高土壤质量具有重要意义。前人对于土壤可溶性盐基离子的研究多聚焦在人类活动影响下土壤可溶性盐基离子空间分布特征[3- 5]、土壤可溶性盐基离子与理化性质的相关性[6]、土壤可溶性盐基离子对植物生长的影响[7-8],不同植被条件下的土壤可溶性盐基离子的变化[9]、盐碱地改良的方法[10- 11]等方面。而对于自然状态下可溶性盐基离子与土壤微生物群落结构相关性的研究较少。

土壤剖面内存在显著的土壤有机质含量[12]和土壤环境因子[13]的变化梯度,为比较微生物结构提供了有利的环境。研究发现,土壤剖面内微生物的变异比不同生态系统表土之间的差异还要强烈[14]。土壤剖面内微生物群落结构主要由土壤有机碳的质量和数量[13]、氮素有效性[15]以及养分含量等[16]共同决定。微生物随土壤深度存在显著的变化[17],且亚表层土壤微生物对土壤形成、生态系统生物化学物质、污染物分解以及维持地下水水质等具有重要意义[18]。另一方面,本研究针对不同土壤深度(0—2 cm,2—25cm)中的可溶性盐基离子的剖面分布,研究微生物群落结构在不同含盐量盐碱土壤中的剖面分布特征,这将有利于揭示土壤可溶性盐基离子在土壤中的动态运移规律及其对土壤生物学特性的影响[19],是探究干旱区盐碱化土壤生物物质循环以及淋溶作用的关键。

目前,关于宁夏典型盐碱化土壤微生物方面的研究主要集中在银北西大滩地区,采用的多是传统的计数法和生物化学方法[20]。如李凤霞等[21]采用平板稀释法和Biolog微生物鉴定系统对宁夏银北不同类型盐化和碱化土壤进行研究发现,随着盐碱化程度加重,土壤细菌、真菌和放线菌数量及微生物总数呈现显著降低的趋势。土壤细菌是土壤微生物的重要组成部分,在土壤有机质分解、腐殖质形成、养分转化与吸收等过程中起到重要作用,其群落结构组成及多样性变化是表征土壤环境质量的敏感指标,因此,在土壤生态学研究中,土壤细菌群落变化是人们探索的重要方向之一。本研究采用高通量测序技术对宁夏不同地区盐碱化土壤样品细菌群落结构进行分析,并分析影响细菌群落结构的关键环境因子,对于揭示土壤微生物特征与不同程度盐碱化土壤关系,为盐碱地土壤的改良利用和可持续发展,盐碱地土壤演变规律提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验样地设在宁夏银北地区,燕子墩乡汪家庄2队、燕子墩乡黄渠拐子村7队、庙台乡李岗村4队、平罗县分水闸村、平罗县银星村、平罗县侯家梁村、西大滩、贺兰县红星村,具体采样地信息见表1。宁夏银北地区属于中温带干旱地区,地势西高东低,海拔1091—1102m。气候特点是干旱少雨,年均降水量172.5mm,全年平均相对湿度为56%,年平均日照时数2800—3200h,年最大风力9级,最大风速18m/s,年均气温8.5℃,昼夜温差8—15℃,极端最高气温30℃,极端最低气温-25℃；全年无霜期155 d。银北地区土壤主要类型为草甸土、盐碱土、灰钙土、白僵土、新积土、沙丘沙地、山地灰褐土和灌淤土,空间异质性大。主要植被为：芨芨草(Achnatherumsplendens(Trin.) Nevski)、苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)、芦苇(Phragmitescommunis(Cav.) Trin. Ex Steud.)等[22]。宁夏平罗县所选地块分布有斑状轻度盐化浅色草甸土,经土壤系统分类检索结合剖面观察,确定该地区盐碱土类型为潮湿碱积盐积土[23]；成土母质为冲积物和洪积物；南高北低,坡度8‰左右；植被稀疏,伴有红柳(Tamarixramosissima)、骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap.)、黑刺(PrunusspinosaL.)等植被,覆盖度小且不均匀。

表1 采样地信息

MT：庙台Miaotai；HQGZ：黄渠拐子Huangquguanzi；YZD：燕子墩Yanzidun；FSZ：分水闸Fenshuizha；YXC：银星村Yinxingcun；HJL：侯家梁Houjialiang；XDT：西大滩Xidatan；HXC：红星村Hongxingcun

1.2 样品采集

于植物生长季6月20日采集根层土壤(0—2cm,2—25cm),采用多点采样的方法,每个试验小区分5点采集土样充分混匀,将新鲜土样过2mm筛后分成2份,一份低温冷藏带回实验室,在-20℃冷冻保存,用于土壤微生物的测定,另一份带回实验室室内风干用于测定土壤理化性质。

1.3 土壤理化性质测定

1.4 土壤可溶性盐基离子浓度测定

1.5 土壤DNA的提取

土壤样品总DNA的提取采用的是MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit(Carlsbad,USA)试剂盒提取总DNA,提取过程按试剂盒说明书进行,DNA样品-20℃冻存。提取的DNA用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段大小。

1.6 Illumina HiSeq测序及数据分析

本研究目标基因为细菌的16S rRNA V4区基因片段,所用的引物为515F/806R[25]。反应体系：15μL Phusion High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs, UK),正反引物各0.2μmol/L,10ngDNA模板。扩增条件参照文献[26]。PCR产物用2%琼脂糖凝胶检测,将目标条带切胶回收纯化进行下一步的分析。

用于PCR扩增的引物外侧都会加入一段barcode序列进行区分,序列为一段6bp碱基的寡核苷酸序列,每个样品用不同barcode序列进行区分。Barcode序列由上海吉美生物医药科技有限公司设计并合成。所得PCR产物经切胶纯化后(Qiagen胶回收试剂盒),用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc. USA)测定浓度,等摩尔混合后采用完成文库构建,安排上机测序。高通量测序由诺禾致源Illumina HiSeq2500平台运行(Beijing, China, http://www.novogene.com/index.php),最后所测得数据在250—300bp之间产生。

所测得原始序列截去Barcode序列和引物序列后,经FLASH(V1.2.7)拼接获得原始数据Tags数据。原始Tags经QIIME(V1.7.0,质控参数为QIIME默认值,参照http://qiime.org/scripts/split_libraries.html)过滤处理获得高质量Tags数据(Clean Tags),并与数据库(Gold database, http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)进行比对(UCHIME Algorithm,http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)检测嵌合体序列,最终获得有效数据(Effective Tags)。测序深度为每个文库原始reads数不少于5万条。以97%相似性为依据,利用UPARSE pipeline软件(V7.0.1001)将各序列聚类成为OTUs。为获得土壤样品中细菌群落的多样性信息,使用uclust软件对所得序列进行聚类,并利用RDP classifier(V2.2)[25]软件与GreenGene数据库(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)进行物种注释,统计每个样品在各分类水平上的构成。

1.7 数据处理

采用Mothur软件计算多样性指数(Chao- 1、Shannon和Simpson 指数)。使用R软件基于Bray-Curits距离算法进行聚类分析。皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)用于分析土壤理化性质与土壤细菌群落间多样性的相关性。采用R软件对环境因子与细菌群落结构进行冗余分析(Redundancy analysis,RDA)。采用SAS中Duncan法检验不同样点土壤属性和微生物指标间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果

2.1 不同类型盐碱地土壤理化性质的分析

不同类型盐碱地土壤理化性质的差异很大。在0—2cm,全氮、有机碳、碱解氮、速效钾在黄渠拐子土壤中含量最高,差异显著(P<0.05)；含水量、pH值和电导率值在西大滩土壤中含量最低,差异显著(P<0.05)(表2)。Pearson相关性分析表明：在0—2cm,速效磷和全磷、电导率值显著正相关(P<0.05),和pH值显著负相关(P<0.05)；碱解氮和速效钾、全氮、有机碳显著正相关(P<0.05)；速效钾和全氮、有机碳、全磷显著正相关(P<0.05)；全氮和有机碳、全磷显著正相关(P<0.05),和电导率值显著负相关(P<0.05)；电导率值和土壤含水量显著正相关(P<0.05)(表3)。

表2 宁夏不同地区盐碱地土壤理化性质

同列数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

表3 土壤理化性质之间的相关系数

2.2 OTU丰度在门水平的变化分析

通过对48个土壤样品的细菌群落分析,共获得高质量序列50072—95545,有效序列49082—93878,在97%相似度下测序覆盖率均在96%以上,说明测序数据量合理,能真实反应土壤微生物的群落组成。

对不同类型盐碱地土壤样品中优势细菌门的分析表明,各种类型盐碱地土壤中相对丰度排名前十的优势细菌分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euryarcheaota)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)(图1)。

表4 宁夏不同地区盐碱地土壤可溶性盐基离子含量

变形菌门是土壤中最为优势的菌群,占24.69%—56.44%。变形菌门的4个亚群的分布在各个样点间有显著差异(P<0.05)(图2)。燕子墩土壤中的γ-变形菌纲相对含量比其他样点显著的高(P<0.05),0—2cm土层,分别高出38.16%—76.59%；2—25cm土层,分别高出65.97%—78.16%。在0—2cm土层,拟杆菌门是第2大优势菌群,其丰度在分水闸样点土壤中含量最高为31.42%,较其他样点高出32.52%—58.58%。在2—25cm土层,燕子墩土壤中的γ-变形菌纲相对含量比其他样点显著高出65.96%—78.15%。在2—25cm土层,放线菌门是第2大优势菌群,其丰度在西大滩样点含量最高为20.42%,高于其他样点14.88%—59.50%。

图1 宁夏不同地区盐碱地土壤细菌各门类相对丰度图Fig.1 Composition and relative abundance of the bacterial community at the phylum level in the soil relative of saline soils in different sampling sites in Ningxia

门图例(自下而上,仅列出有对应中文名称的门)(图1)：变形菌门Proteobacteria；拟杆菌门Bacteroidetes；放线菌门Actinobacteria；厚壁菌门Firmicutes；广古菌门Euryarcheaota；芽胞单菌门Gemmatimonadetes；酸杆菌门Acidobacteria；蓝细菌门Cyanobacteria；浮霉菌门Planctomycetes；绿弯菌门Chloroflexi；疣微菌门Verrucomicrobia；梭杆菌门Fusobacteria；其他分类未定others。

2.3 不同类型盐碱地土壤细菌群落在属水平的丰度变化分析

从属水平对不同样品中细菌的相对丰度变化分析表明,相对丰度排名前35的细菌属的总比例分别占不同盐碱化土壤测序reads数的18.52%—41.98%。

在0—2cm土层,Bacillus在八个样点中的相对丰度都> 1.0%,Bacillus属于厚壁菌门；unidentified_OM1_clade在除了分水闸以外的其他七个样点的相对丰度>1%(表5)。Salinibacter的相对丰度在庙台样点显著高于其他样点(P<0.01)；unidentified_OM1_clade的相对丰度在黄渠拐子显著高于其他样点(P<0.01)；Rhodoferax的相对丰度在燕子墩显著高于其他样点(P<0.01)；Aliifodinibius、Salinimicrobium、Gillisia、Nafulsella和Marinobacter在分水闸样点的相对丰度显著高于其他样点(P<0.01)；Bacillus和H16的相对丰度在银星村显著高于其他样点(P<0.01)；Rubrobacter的相对丰度在西大滩显著高于其他样点(P<0.01)；Aidingimonas和Saccharospirillum的相对丰度在红星村显著高于其他样点(P<0.01)。

在2—25cm土层中,unidentified_OM1_clade和Bacillus在几乎所有样点的相对丰度均> 1.0%(表5)。Candidatus_Entotheonella的相对丰度在黄渠拐子显著高于其他样点(P<0.01)；H16、Pelagibius和Cetobacterium相对丰度在银星村显著高于其他样点(P<0.01)；Acinetobacter相对丰度在侯家梁显著高于其他样点(P<0.01)；Thiobacillus相对丰度在红星村显著高于其他样点(P<0.01)。

2.4 α多样性指数

不同采样点土壤细菌群落多样性指数Shannon、Simpson和丰富度指数Chao- 1、ACE如表6所示。在0—2cm土层,燕子墩样点的Shannon和Simpson指数显著低于其他样点(P<0.05)。Chao- 1指数变化趋势与Shannon指数一致。在2—25cm土层,燕子墩样点的Shannon指数显著低于其他样点(P<0.05)。分水闸样点的Chao- 1和ACE指数显著高于其他样点(P<0.05)。

表5 各个样点土壤细菌群落在属水平上的丰度变化

图2 各个样点土壤变形菌亚群分布情况Fig.2 Distribution of Proteobacteria subgroups in the soil relative to mode of the different sampling sites

表6 各样点土壤样品alpha多样性分析

同列数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.5 不同类型盐碱地土壤中细菌群落结构主成分分析

主成分分析发现,在0—2cm土层,西大滩、庙台、红星村、黄渠拐子与其他处理结构差异较大；分水闸、燕子墩、侯家梁和银星村土壤中细菌群落结构无明显差异(图3)。

图3 宁夏不同地区盐碱地土壤细菌群落结构的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of bacterial community composition of saline soils in different sampling sites in Ningxia

2.6 细菌群落与土壤理化因子的关系

表7 0—2cm土层土壤细菌多样性指数与土壤属性Pearson相关性分析

通过R软件对环境因子和土壤细菌群落进行RDA分析。由图4可知,在0—2cm土层,第一排序轴和第二排序轴分别解释了细菌群落变化的28.94%和16.74%,经过蒙特卡罗检验,土壤含水量(F=3.4,P=0.04)和电导率值(F=4.9,P=0.006)是土壤微生物群落的主要影响因子；在2—25cm土层,第一排序轴和第二排序轴分别解释了细菌群落变化的53.29%和20.11%,经蒙特卡罗检验土壤理化因子与细菌群落结构没有显著相关性,P>0.05。

表8 2—25cm 土层土壤细菌多样性指数与土壤属性Pearson相关性分析

图4 不同类型盐碱地土壤性质与细菌群落的RDA分析Fig.4 Results from redundancy analysis (RDA) to explore the relationship between soil bacterial community and soil physicochemical characteristicsMT：庙台Miaotai；XDT：西大滩Xidatan；YZD：燕子墩Yanzidun；YXC：银星村Yinxingcun；HJL：侯家梁Houjialiang；HQGZ：黄渠拐子Huangquguanzi；HXC：红星村Hongxingcun；FSZ：分水闸Fenshuizha

3 讨论

本研究发现的大部分微生物都属于嗜盐和耐盐菌株,它们分别属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门[30]。γ-变形菌纲在原生盐碱土和次生盐碱土中均有优势类群[31- 32],这与本研究结果一致。γ-变形菌纲包含许多促植物生长细菌(PGPR)[33],如具有固氮作用的芽孢杆菌属、固氮菌属(Azotobacter),在生产和释放植物激素[34- 35]和土壤源植物病原菌(如真菌)的生物防治[36]中有重要作用。厚壁菌门是我国许多盐渍化土壤中的优势菌群[37],其中许多细菌可耐受极端条件,如干旱、盐碱等环境,很多厚壁菌可以产生芽孢,能够抵抗脱水,适应干旱和极端环境的能力极强。研究表明拟杆菌门对高盐环境具有较强的抗性,是盐碱土壤中的优势种群[32],这在本研究中得到了证实。本研究发现放线菌门在土壤含水量较低的西大滩和侯家梁土样中相对含量高于其他采样点,放线菌门是好气性微生物,土样含氧量较高的环境更适合放线菌门的生长[22]。

从属水平分析,发现芽孢杆菌属在八个样点的相对丰度均>1%,已有的研究表明芽孢杆菌属于嗜碱微生物[38]。芽孢杆菌产生芽孢,能够抵抗脱水,适应干旱和极端环境能力极强[22]。假单胞菌属在新疆阿克苏地区盐碱地和河西走廊盐碱化土壤细菌群落中都是优势菌属[32- 39]。本研究中,在0—2cm和2—25cm土层,假单胞菌属在燕子墩和侯家梁样点的相对丰度均高于其他样点。这类微生物的特殊代谢机制和产生的特殊酶已经在实践中显示了巨大的应用价值[40]。本研究结果为从盐碱土壤中分离筛选出可耐盐碱的菌株提供了参考依据。

宁夏地处干旱半干旱区,土壤含水量、pH、土壤电导率、有机质含量、氮元素、磷元素、阴阳离子的含量[41]等诸多因素都影响土壤微生物的空间分布格局。相关性分析表明土壤营养元素、pH值等对土壤细菌群落结构和多样性没有显著的影响,分析其原因可能是因为本试验采集的土样均为未开垦的原始盐碱荒地,人为的扰动很少,没有化肥和有机肥的营养元素输入,因此土壤碳、氮素等营养对细菌群落结构的影响相对而言没有自然环境因子(如：土壤水分、电导率值和土壤盐基离子含量等)的效果更加显著。在本研究中,水分是细菌群落的关键影响因子,这与以往的研究结论一致。研究表明微生物生物量和多样性随着土壤含水量的增加而增加,并通过进一步的相关性分析指出,土壤含水量在0—15%范围内时,干旱半干旱区土壤细菌、真菌群落的多样性与土壤含水量呈显著正相关关系[42]。

在盐渍化地区,含盐量是土壤微生物群落结构的重要限制因子。随着土壤盐渍化程度增加,土壤中细菌、真菌、放线菌数量及微生物数量均呈现出明显的下降趋势[43]。本研究中,细菌群落的多样性和丰富度指数均与电导率值呈显著的负相关,说明土壤中过高的盐分含量对微生物的生长繁殖具有明显的抑制作用,从而影响微生物区系结构,其主要原因是盐分影响水分的有效性或微生物细胞的生理和代谢过程[44]。本研究发现土壤含水量和土壤电导率值呈显著的正相关。因此,含水量和盐分的交互作用影响微生物群落。

4 结论